金龍膽草總皂苷誘導(dǎo)Hela細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞凋亡的研究

劉培，周立軍，蘇艷芳，顏世倫（.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津市300072；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，石家莊市 050026）

金龍膽草為白酒草屬植物苦蒿Conyza bliniiLevl.的干燥全草，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，系20世紀(jì)70年代四川省發(fā)掘的民間草藥，具有清熱解毒、消炎祛痰、止咳平喘之功效，臨床用于治療慢性氣管炎、胃腸炎、腎炎、肝炎、痢疾、口腔炎、中耳炎、風(fēng)火牙痛、濕疹、痔瘡、外傷出血、燙火傷及牲畜創(chuàng)傷[1]。金龍膽草及其制劑在1997年版《中國(guó)藥典》（一部）和《四川省藥品標(biāo)準(zhǔn)》中收載[2]。目前關(guān)于金龍膽草是否具有抗癌活性的報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)。本研究以宮頸癌Hela細(xì)胞和肺癌SPC-A1細(xì)胞為模型，旨在通過研究金龍膽草總皂苷對(duì)Hela細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞增殖的影響，探討金龍膽草總皂苷的抗癌機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XD-101型倒置生物顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；SUNRISE型酶標(biāo)儀（上海麥莎生物科技有限公司）；BioDoc-It 220型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.2 試藥

金龍膽草產(chǎn)于四川省涼山州，經(jīng)天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院周立軍副教授鑒定為真品；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司）；蛋白酶K、RNA酶A（RnaseA，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；羊抗兔半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3（Caspase-3）單克隆抗體、羊抗兔α-actin單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP抗體（武漢博士德生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.3 細(xì)胞

宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞和肺癌細(xì)胞系SPC-A1細(xì)胞，購(gòu)自天津市腫瘤研究所。

2 方法

2.1 金龍膽草總皂苷的制備

按順序進(jìn)行下列步驟：（1）將經(jīng)過粉粹的金龍膽草在90%無(wú)水乙醇中加熱回流提取2次，每次2 h，過濾后將濾渣用55%～65%的乙醇加熱回流提取2 h并過濾，將2次濾液合并，然后減壓濃縮至乙醇完全揮發(fā)；（2）將上述濃縮液用蒸餾水稀釋至濃度為10～20 g·100 mL-1，然后在分液漏斗中用等量乙酸乙酯萃取4次以去除雜質(zhì)，并將水層減壓蒸至乙酸乙酯完全揮發(fā)，之后再于分液漏斗中用等量正丁醇萃取多次，直至萃取完全，最后將合并后的正丁醇萃取液減壓濃縮而得到粗皂苷；（3）將上述粗皂苷溶于水并經(jīng)大孔樹脂D101柱層析，然后依次用水、30%乙醇、70%乙醇和95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，最后將70%的乙醇洗脫物減壓濃縮，即可得到金龍膽草總皂苷[3]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞以1×107個(gè)·mL-1的濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入RPMI 1640培養(yǎng)液（含5%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素）適量，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后換液去除未貼壁細(xì)胞，倒置生物顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。將長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原培養(yǎng)液棄去，PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶溶液，以使充分浸潤(rùn)，一般消化時(shí)間為3 min，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液中和胰酶，終止消化，視試驗(yàn)要求傳入多瓶繼續(xù)培養(yǎng)，一般為一傳二到一傳四的比例[4]。

2.3 MTT法檢測(cè)金龍膽草總皂苷對(duì)細(xì)胞的抑制作用

用0.25%的胰酶消化液1 mL，37℃消化細(xì)胞3 min，顯微鏡下觀察胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大即細(xì)胞變圓后，終止消化；加入含10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)液中和胰酶；細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋至2×104個(gè)·mL-1，加入96孔板中，每孔加200 μL細(xì)胞懸液；待細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期加入藥物；用培養(yǎng)基將試驗(yàn)組（金龍膽草總皂苷，根據(jù)提取單品的質(zhì)量和分子量計(jì)算出總皂苷的分子量約為1 200）和陽(yáng)性對(duì)照組（順鉑，DDP）10倍系列稀釋，濃度依次為 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol·L-1，并做空白對(duì)照。加藥分別孵育24、48、72 h后，加5 g·L-1MTT繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制率（IC50）。細(xì)胞抑制率（%）＝（1－試驗(yàn)或陽(yáng)性對(duì)照組A值）/空白對(duì)照組A值×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.4DNA凝膠電泳

將陽(yáng)性對(duì)照組和試驗(yàn)組分別加入含有IC50（mol·L-1）濃度藥物的培養(yǎng)液，空白對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后吸出培養(yǎng)液并用胰酶消化，離心棄上清，PBS漂洗2次，加細(xì)胞核裂解液500 μL重懸細(xì)胞，50℃水浴3 h；加0.5 mL Tris飽和酚抽提，4 ℃、6 000 r·min-1離心5 min，上清移至新離心管；加入等體積氯仿-異戊醇（24∶1）抽提，離心，上清移至新離心管；加50 μL 3 mol·L-1乙酸鈉和2 mL預(yù)冷無(wú)水乙醇，上下顛倒幾次混勻，可見絮狀白色沉淀物。置－20℃冰箱中30 min，4℃、12 000 r·min-1離心10 min沉淀 DNA，晾至半干后，加入含5 μL Rnase A的TE緩沖液50 μL，37℃水浴30 min即可。制備1%瓊脂糖凝膠電泳，DNA樣品與上樣緩沖液混勻上樣，置1×TAE電泳緩沖液中，室溫、恒流75 mA電泳1～2 h，以DNA Marker DL2 000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2.5 Western Blot法[5]檢測(cè)藥物對(duì)Caspase-3含量的影響

將細(xì)胞傳代至培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組和試驗(yàn)組分別加入含有IC50（mol·L-1）濃度藥物的培養(yǎng)液，空白對(duì)照更換新鮮培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PBS漂洗，加4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液[1 mol·L-1Tris-HCl（pH8.0）、0.15 mol·L-1NaCl、1%TritonX-100、0.5 mmol·L-1PMSF），于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min。最后將離心后的上清液分裝到離心管中放于－20℃保存。采用10%分離膠、4%濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜儀（400 mA，2 h）將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，搖床輕搖1 h，TBST（包含Tris-Hcl緩沖液+吐溫20）漂洗15 min×3次，加一抗（含兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體和兔抗鼠α-actin單克隆抗體的5%脫脂奶粉液），4℃輕搖過夜。次日取出膜，用TBST漂洗15 min×3次，加入二抗（含羊抗兔IgG-HRP的5%脫脂奶粉液），室溫輕搖1 h，TBST洗膜15 min×3次。滴加1∶1 ECL顯色液于膜上，反應(yīng)3 min，壓片5 min，將膠片置于顯影液和定影液各5 min后觀察。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS11.50統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

Hela細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞均為上皮樣細(xì)胞，呈多角形、鋪路石狀生長(zhǎng)。倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)A.Hela細(xì)胞；B.SPC-A1細(xì)胞Fig1 Morphology of cells observed by inverted microscopeA.Hela cells；B.SPC-A1 cells

3.2 金龍膽草總皂苷對(duì)Hela和SPC-A1細(xì)胞的抑制作用

以10-3～10-7mol·L-1濃度金龍膽草總皂苷孵育細(xì)胞24、48、72 h后，測(cè)定金龍膽草總皂苷對(duì)Hela細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。細(xì)胞抑制率與藥物濃度及作用時(shí)間相關(guān)。隨藥物濃度增加，金龍膽草總皂苷對(duì)2種細(xì)胞的抑制率增高。隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，金龍膽草總皂苷對(duì)細(xì)胞的抑制作用越發(fā)明顯。48 h時(shí)，Hela細(xì)胞的IC50＝1.25×10-5mol·L-1，SPC-A1細(xì)胞的IC50＝1.03×10-5mol·L-1。金龍膽草總皂苷對(duì)Hela、SPC-A1細(xì)胞抑制作用的影響見表1、表2。

3.3 DNA凝膠電泳分析

表1 金龍膽草總皂苷對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用的影響（±s）Tab1 Influence of total saponins from C.blinii on Hela cell（±s）

表1 金龍膽草總皂苷對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用的影響（±s）Tab1 Influence of total saponins from C.blinii on Hela cell（±s）

抑制率/%濃度/mol·L-1DDP 金龍膽草總皂苷10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 24 h 5.54±0.17 6.37±0.24 20.25±1.19 44.63±2.11 60.01±2.37 48 h 7.74±0.21 8.72±0.24 49.86±1.52 72.52±2.16 80.35±2.65 72 h 7.93±0.35 10.53±0.37 50.57±2.34 77.25±2.86 86.44±2.38 24 h 6.58±0.19 6.96±0.25 22.18±1.26 45.86±2.05 62.18±2.49 48 h 8.24±0.22 9.52±0.26 51.36±1.56 79.82±2.14 86.48±2.75 72 h 9.73±0.36 12.58±0.47 57.94±2.89 82.14±2.75 91.45±2.96

DNA凝膠電泳圖譜呈現(xiàn)梯子狀斷裂現(xiàn)象是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志[6]。凋亡時(shí)限制性核酸內(nèi)切酶被激活，將DNA切成50～300 kb的大分子量DNA，進(jìn)一步分解成規(guī)則的180～200 bp DNA片段或它的倍數(shù)片段。結(jié)果顯示，空白對(duì)照在瓊脂糖凝膠電泳上顯示相對(duì)分子質(zhì)量很大的一條帶，這是基因組DNA條帶，說(shuō)明沒有發(fā)生凋亡，而金龍膽草總皂苷出現(xiàn)了凋亡的特征性DNA ladder，并且有模糊的連續(xù)條帶出現(xiàn)，說(shuō)明金龍膽草總皂苷除誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡外，也導(dǎo)致少數(shù)細(xì)胞壞死。DNA瓊脂糖凝膠電泳分析見圖2。

表2 金龍膽草總皂苷對(duì)SPC-A1細(xì)胞抑制作用的影響（±s）Tab2 Influence of total saponins of C.blinii on SPC-A1cells（±s）

表2 金龍膽草總皂苷對(duì)SPC-A1細(xì)胞抑制作用的影響（±s）Tab2 Influence of total saponins of C.blinii on SPC-A1cells（±s）

抑制率濃度/mol·L-1DDP 金龍膽草總皂苷10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 24 h 5.28±0.18 5.96±0.23 21.78±1.29 43.86±2.13 63.26±2.53 48 h 6.34±0.23 8.92±0.27 50.38±1.65 76.42±2.17 81.67±2.57 72 h 9.63±0.31 12.23±0.57 53.37±2.94 80.08±2.59 86.46±3.06 24 h 6.12±0.16 6.89±0.18 24.16±1.01 47.28±2.16 71.26±2.38 48 h 7.12±0.19 10.98±0.21 56.35±1.74 81.95±2.17 85.78±2.34 72 h 10.25±0.21 14.67±0.38 59.86±1.89 85.43±2.71 88.76±2.45

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析A.Hela細(xì)胞；B.SPC-A1細(xì)胞；1.DDP；2.Marker；3.金龍膽草總皂苷；4.空白對(duì)照Fig2 Agarose gel electrophoresis analysis of DNAA.Hela cells；B.SPC-A1 cells；1.DDP；2.Marker；3.Total saponins of C.blinii；4.blank control

3.4 細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白含量測(cè)定結(jié)果

藥物作用前后Caspase-3的表達(dá)量有顯著變化，Hela細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照，進(jìn)一步從蛋白水平上說(shuō)明金龍膽草總皂苷能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Western blot檢測(cè)金膽草總皂苷對(duì)Caspase-3表達(dá)量的影響見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)金龍膽草總皂苷對(duì)Caspase-3表達(dá)量的影響A.Hela細(xì)胞；B.SPC-A1細(xì)胞Fig3 Effects of Total saponins of C.blinii on Caspase-3 deteced by Western blot assayA.Hela cells；B.SPC-A1 cells

4 討論

金龍膽草系菊科白酒草屬植物，全世界共有80余種，對(duì)其中約20種植物的化學(xué)研究表明，二萜類、黃酮類和多聚炔類化合物是白酒草屬植物的特征成分。早在2000年，Su YF等[7]對(duì)金龍膽草黃酮類成分、萜類成分、皂苷類成分等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。除黃酮類、二萜類化合物外，從白酒草屬植物中獲得的天然產(chǎn)物的新類型包括三萜皂苷、鞘脂化合物、γ-吡喃酮3種。近年來(lái)，對(duì)白酒草屬植物化學(xué)成分的研究取得較大進(jìn)展，但有關(guān)白酒草屬植物化學(xué)成分生物活性的研究很少，僅有報(bào)道conyzasaponin D和conyzasaponin F對(duì)HL-60具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒性[8]，γ-吡喃酮類化合物具有抗真菌活性[9]，黃酮luteolin、apigenin、takakin 8-O-glucuronide 對(duì)黃嘌呤氧化酶具有抑制活性等。因此，有必要系統(tǒng)研究白酒草屬植物化學(xué)成分的生物活性，以期闡明其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)。

在腫瘤的分子生物學(xué)研究中，腫瘤的發(fā)生機(jī)制有很多，但細(xì)胞凋亡始終是學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，凋亡是通過啟動(dòng)其自身遺傳機(jī)制，內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活，而發(fā)生自動(dòng)死亡的過程。各種組織的細(xì)胞凋亡都要激活Caspase家族，Caspase家族成員能迅速啟動(dòng)序列性酶解死亡程序并激活核酸內(nèi)切酶[10]。在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用下，DNA進(jìn)行有控降解。其中，Caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一類蛋白水解酶，即Caspase家族中的關(guān)鍵效應(yīng)酶，是凋亡途徑的最終執(zhí)行者，可直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起細(xì)胞凋亡[11]。

本試驗(yàn)以宮頸癌Hela細(xì)胞和肺癌SPC-A1細(xì)胞為研究模型，選擇臨床常用的順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照，通過MTT試驗(yàn)、瓊脂糖凝膠電泳和Western Blot試驗(yàn)，說(shuō)明金龍膽草總皂苷可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并出現(xiàn)特征性DNA ladder，增加Caspase-3表達(dá)量，即依次從細(xì)胞水平、分子水平和蛋白水平表明金龍膽草總皂苷抑制Hela細(xì)胞和SPC-A1細(xì)胞的增殖活性是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但是，有關(guān)金龍膽草總皂苷誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞和肺癌SPC-A1細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

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