谷文喜,袁 潔,陳 晶,顏 瑾,鄧小玲,柯昌文,何劍鋒

2.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣州 510080;

3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣州 510640

狂犬病是由狂犬病病毒引起的急性致死性人獸共患傳染病,主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng),造成受害動物極度興奮、狂躁不安和意識障礙,一旦發(fā)病,病死率100%。我國是世界上狂犬病第二嚴(yán)重國家,疫情主要集中在南方各省,廣東省是我國狂犬病高發(fā)省之一,犬是廣東省狂犬病的主要傳播動物。調(diào)查發(fā)現(xiàn),在發(fā)病者中有 81.51%～95.7%的感染都來自犬[1-6],說明在狂犬病的流行中,犬在其中起著重要的作用。為了了解健康犬對人潛在的威脅程度,我們對廣東省境內(nèi)外表健康犬的狂犬病毒帶毒率進行了調(diào)查。

1 實驗材料和方法

1.1 標(biāo)本的采集 于2008年在廣東省境內(nèi)隨機抽取10個地市,對待銷售的食用犬及流浪犬進行犬腦(海馬回、小腦、中腦和大腦)的采集,標(biāo)本冷鏈送往廣東省CDC檢測。

1.2 方法 用WHO推薦的狂犬病實驗室診斷方法直接免疫熒光法(DFA)對所有犬腦組織樣品進行狂犬病病毒抗原篩查檢測,陽性樣品再用巢氏聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和小鼠感染法(MIT)進行復(fù)核檢測。陽性RT-PCR產(chǎn)物純化(QIA quick PCR Purification Kit)后,直接進行測序并和部分已發(fā)表狂犬病病毒序列進行比對。

1.2.1 DFA檢測犬腦組織中病毒抗原

1.2.1.1 制備腦組織印片 取大腦、中腦和小腦3個部分的橫斷面,均勻涂印于酒精處理過的干燥載玻片上,室溫干燥后,冷丙酮(-20℃)固定過夜。

1.2.1.2 熒光染色 固定好的載玻片取出吹干,將稀釋好的狂犬病毒熒光抗體(Rabies IFA Reagent,美國Chemicon公司)滴加在腦組織印跡上(確保完全覆蓋),然后放入濕盒中,37℃,30min,用緩流沖洗抗原片15s,再用PBS振洗2遍,浸泡1遍,吹干,90%甘油(PBS)封片。

1.2.1.3 熒光顯微鏡觀察 仔細(xì)觀察每個視野的熒光強度,結(jié)合其分布狀況進行判定。以觀察到特異性翠綠色點狀熒光判為陽性,否則為陰性。

1.2.2 RT-PCR法檢測DFA陽性及可疑陽性樣本中的病毒核酸 對DFA初檢中的陽性和可疑陽性樣本進行狂犬病毒特異性核蛋白基因(N)片段的檢測,引物序列及相關(guān)信息見表1。

表1 PCR擴增引物及相關(guān)信息Table 1 Primers sequences used for the PCR

1.2.2.1 標(biāo)本RNA的提取 取DFA陽性犬的不同部位腦組織共約100 mg,加入200 μ L Trizol(美國 Invitrogen公司),研磨機研磨均勻,補Trizol加至1 000 μ L,快速顛倒離心管30～40次充分混勻內(nèi)容物,室溫放置5 min;加 200 μ L氯仿,快速顛倒離心管數(shù)次(30 s),使其呈淡粉紅色,室溫放置3 min;4℃離心,12 000 r/min,15 min;取離心后水相600 μ L,加入到已有 600 μ L異丙醇的新的離心管中,輕柔混勻。室溫放置10 min;4℃離心,12 000 r/min,10 min;緩緩倒掉上清,用槍頭輕輕吸去殘存液體,可見少量沉淀;加1 mL 75%乙醇(DEPC H2O新鮮配制)洗滌沉淀;4℃離心,12 000 r/min,10 min;緩緩倒掉上清,用槍頭輕輕吸去殘存液體,室溫干燥數(shù)分鐘;沉淀溶于70 μ L DEPC水中,分裝于2個離心管中,直接進行逆轉(zhuǎn)錄或-70℃儲存。

1.2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA Pd(N)6稀釋至0.2 μ g/μ L。水浴預(yù)熱至65 ℃,33 μ L RNA 液 65 ℃水浴 10 min,冰浴 2 min,瞬時離心 ;將 32 μ L RNA 液轉(zhuǎn)移至逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管(Ready-To-GO You-Prime First-Strand Beads,美國Amersham 公司)中,加入1 μ L隨機引物Pd(N)6(Takara公司),使總體積達到 33 μ L;室溫放置1 min,混勻,瞬時離心;37 ℃水浴,60 min,得到cDNA,-20℃或-70℃保存。

1.2.2.3 RT-PCR 將上游引物N127,下游引物N829和cDNA加入Go Taq Green Mix(美國Promega公司)中,進行第一次 PCR循環(huán),條件為：94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,56℃退火30s,72℃延伸40 s,共35個循環(huán);72℃延伸10 min。以第1次反應(yīng)產(chǎn)物作為模板,并加入上游引物N371F和下游引物N371R,進行第二次PCR反應(yīng),反應(yīng)條件與第一次反應(yīng)條件相同。以DL2000(Takara公司)為Marker,在2%瓊脂糖凝膠上電泳,觀察結(jié)果。

1.2.3 MIT試驗 采用RT-PCR檢測陽性犬的腦組織2份,分別加緩沖鹽水研磨,制成20%的懸液,腦內(nèi)10 μ L接種5只乳鼠,接種后繼續(xù)由母鼠喂養(yǎng),每天觀察發(fā)病情況,在9～17d內(nèi)出現(xiàn)震顫、麻痹或死亡者,取出腦組織,做 DFA和 RT-PCR檢測驗證。

1.2.4 核酸測序 PCR陽性擴增產(chǎn)物用Qiagen公司膠回收試劑盒純化,用PCR引物進行測序反應(yīng)并純化產(chǎn)物,再用ABI PRISM○R3130測序儀進行測序。測序結(jié)果的比對及基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建均使用MEGA 4軟件包以鄰位相連法(NJ)完成。所用參考毒株N基因序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫,具體信息見表2。

2 結(jié) 果

所有1 833份腦組織樣本先用DFA法進行初篩,共檢出陽性和可疑陽性樣本325份,陽性率為17.73%。對這325份腦組織陽性或可疑樣本進行RT-PCR法檢測,得到陽性結(jié)果2份,占 1 833份的0.11%。把這2份陽性樣品分別用MIT法再次檢驗,結(jié)果都為狂犬病病毒陽性。

2.1 DFA法檢測結(jié)果 共有325份標(biāo)本腦印片觀察到翠綠色點狀熒光。狂犬病病毒抗原陽性和陰性照片見圖1。

2.2 RT-PCR法檢測結(jié)果 對325份DFA陽性樣本進行RT-PCR檢測,有2份樣本電泳顯示得到與目的片段(371bp)大小一致的條帶,其它樣本均無條帶,見圖 2。

表2 廣東省分離狂犬病毒毒株與參考毒株相關(guān)信息Table 2 Information of viruses'gene used in this study

圖1 DFA法檢測狂犬病病毒抗原照片F(xiàn)ig.1 The picture of rabies antigen by DFA：positive(left),negative(right)

2.3 MIT法檢測結(jié)果 發(fā)病及死亡鼠腦組織做DFA檢測,鏡檢觀察到典型的翠綠色尼基氏小體,且RT-PCR電泳也出現(xiàn)了371 bp的目的大小條帶,可以證明確實是狂犬病毒感染。

2.4 核蛋白基因(N)片段序列分析 對廣東分離株與參考毒株的N基因片段做進一步測序分析,結(jié)果顯示廣東分離的2個毒株都屬于狂犬病毒I型,與其它部分已發(fā)表毒株基因序列的系統(tǒng)進化樹關(guān)系如圖3,廣東分離株GD1和GD2同源性為99.8%;與湖南株GX01同源性最高分別為99.4%和99.3%;在四個疫苗株中,廣東分離株與CTN株的同源性最高分別為94.6%和94.5%,與印度、印度尼西亞和泰國分離株比較,與泰國分離株同源性最高為88.5%～89%。

3 討 論

近幾年狂犬病在我國呈高發(fā)態(tài)勢。由于犬與人類的接觸最為密切,且犬仍然是狂犬病流行的重要宿主動物和傳染源[7],因此掌握外觀健康犬的帶毒情況對狂犬病的防控有著重要意義。通過序列分析顯示廣東分離到的兩毒株同源性在99.8%,表明它們有著共同的來源;廣東株與湖南株HuNPN01、廣西株GX01處于同一分支中,親緣關(guān)系最近,考慮到三省互臨,我們推測該類狂犬病毒在三省間可能呈循環(huán)傳播。值得注意的是,雖然湖南株HuNPN01分離自豬,但流行病學(xué)資料顯示,此次豬群間爆發(fā)的狂犬病是由豬場主鄰居家一條發(fā)病犬竄入豬場咬傷豬只而引起的[8],這至少說明此型病毒依然主要是在犬中流行;在我國目前使用的 4個疫苗株中,CTN與廣東毒株親緣關(guān)系最近,提示在病毒分離地區(qū)使用CTN株疫苗對犬只進行免疫應(yīng)能取得較好的保護效果;與東南亞三個鄰國毒株序列的比較,發(fā)現(xiàn)廣東株與泰國株和印度尼西亞株的同源性最為接近,預(yù)示三地間狂犬病毒有一定的聯(lián)系,需要做更深入的流行病學(xué)研究。

直接熒光抗體法(DFA)是WHO推薦的實驗室診斷方法,也是我國狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS281-2007)中指定的狂犬病病毒抗原檢測方法之一。我國狂犬病診斷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,臨床確診病例加上以下的任何一項,即DFA或ELISA檢測狂犬病病毒陽性、RT-PCR檢測狂犬病病毒核酸陽性或細(xì)胞培養(yǎng)分離到狂犬病病毒,就可以做為實驗室確診病例。本研究中由于檢測的是外觀健康犬(非發(fā)病犬),因此使用了DFA和RT-PCR兩種方法結(jié)合進行檢測,其優(yōu)點是DFA法成本低、操作簡便、快速,便于進行批量篩查檢測,RT-PCR法敏感、準(zhǔn)確、結(jié)果客觀。本研究1 833份樣本中DFA檢測陽性325份,陽性率為17.73%,這一結(jié)果與此前報道廣東省外觀健康犬的帶毒率為17.7%[9]一致。而后對這325份DFA陽性樣本進行RT-PCR法檢測,陽性結(jié)果2份,計算得出總體陽性率為0.11%。兩種檢測方法的結(jié)果差異非常大,造成這種DFA方法檢測陽性率過高現(xiàn)象的原因可能是：此前報道的帶毒率為17.7%的研究方法與本研究中的DFA法原理相似,都是利用免疫熒光原理對狂犬病病毒抗原進行檢測,但是在制片過程中如果印片過厚或沖洗不徹底易發(fā)生熒光染料非特異性堆積,進而造成假陽性結(jié)果[10];由于是對非發(fā)病犬樣本進行檢測,即使樣本含有病毒顆粒也可能數(shù)量較少,這在結(jié)果判定上不易區(qū)分非特異殘存熒光顆粒和這種弱陽性熒光顆粒之間的差異,往往容易把少量存在的非特異殘存熒光顆粒判定為弱陽性;就DFA方法本身而言,對于可疑陽性樣本的判定,觀察者主觀因素的影響是很大的,有報道在同一實驗室由于操作者和試劑不同,其前后兩次的DFA結(jié)果也不同[11]?；谝陨显?對DFA可疑陽性樣本有必要再用 RT-PCR法進行復(fù)核檢測,最終應(yīng)以兩種方法都為陽性者判為陽性結(jié)果,這種組合檢測方法已被越來越多的實驗室用于組織樣本中狂犬病毒抗原的檢測[12-15]。而本研究中使用的RVN371巢式PCR法擴增的特異性N基因片段具有很高的特異性,其序列通過分析能夠反映出不同毒株間的遺傳衍化關(guān)系[16-18],可對狂犬病毒的核酸進行有效檢測。

廣東省是我國狂犬病發(fā)病最嚴(yán)重的省份之一,防控狂犬病刻不容緩。除了要繼續(xù)加大對狂犬病的預(yù)防控制和宣傳力度外,也要加強對狂犬病的監(jiān)測能力,要讓狂犬病的監(jiān)測做到常態(tài)化,及時掌握廣東省內(nèi)及周邊省份乃至鄰國的狂犬病流行動態(tài),為可能爆發(fā)的疫情做好準(zhǔn)備。

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