王 茜， 鄧鳳君， 林煥冰， 徐江平△

(1南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理課題組，廣東廣州510515;2益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理教研室，湖南益陽413000)

再灌注治療是急性心肌梗死的重要治療手段。然而再灌注治療在迅速恢復(fù)缺血心肌的血流、挽救大量瀕死心肌的同時也導(dǎo)致心肌明顯損傷，即“缺血再灌注損傷 (ischemia reperfusion injury，I/R)”。缺血再灌注損傷的發(fā)生降低了臨床治療效果。建立減少缺血再灌注損傷的治療方案是最近30年急性心肌梗死治療的重要研究方向。有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血發(fā)生之前進行缺血預(yù)適應(yīng)干預(yù)可以發(fā)揮心臟保護作用，但由于缺血事件不可預(yù)知性，該措施則難以應(yīng)用。近年大量實驗研究與臨床應(yīng)用表明，在心肌缺血后、恢復(fù)長期血流之前，進行一次或數(shù)次短暫重復(fù)的缺血/再灌注處理，即缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning)能提高缺血心肌對之前發(fā)生的較長時間缺血的耐受性。與預(yù)適應(yīng)相比，它具有更好的可預(yù)測性和臨床可控性［1］。但缺血后適應(yīng)也可能會導(dǎo)致潛在的并發(fā)癥。因而有學(xué)者提出“藥物后適應(yīng)”，即通過使用模擬內(nèi)源性機制的藥物來發(fā)揮后適應(yīng)的保護作用。而應(yīng)用藥物后適應(yīng)則需要對后適應(yīng)的機制進行研究。

第二信使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)參與對心臟廣泛的細胞功能和形態(tài)學(xué)過程，包括心肌變力狀態(tài)、變時性、凋亡和肥大的調(diào)節(jié)過程。且有研究發(fā)現(xiàn)活化腺苷酸環(huán)化酶(adenyl cyclase，AC)/cAMP通路的藥物能引出缺血心肌的延遲保護作用［2］。但cAMP在后適應(yīng)中的作用還不是很清楚。因此我們采用離體心臟灌流模型，觀察后適應(yīng)對心臟組織的保護作用，以及AC抑制劑SQ22536和磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDE4)抑制劑洛利普蘭(rolipram)對后適應(yīng)的影響，探討cAMP在后適應(yīng)保護心臟中的作用。

材料和方法

1 材料

Sprague－Dawley(SD)大鼠(210－260 g)由廣州南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為粵檢證字第2006－0015號;PCLab生物信號采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達科技發(fā)展有限公司);肌酸激酶(creatine kinase，CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測試盒均購自南京建成生物工程研究所，洛利普蘭和SQ22536購自Sigma－Aldrich。

2 方法

2．1 實驗分組與模型建立 51只大鼠隨機分為6組。2.5%戊巴比妥鈉 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉，舌下靜脈注射肝素1 000 IU/kg抗凝。開胸迅速取心臟，置于4℃改良K－H液中，排盡殘血后經(jīng)主動脈將心臟懸掛于Langendorff灌流裝置上，用37℃經(jīng)混合氣(95%O2和5%CO2)平衡的K－H緩沖液行主動脈逆行灌流(灌注壓為80 cmH2O)。K－H液成分(mmol/L):NaCl 118，KCl 4.7，CaCl21.25，MgSO41.2，NaHCO325，KH2PO41.2，glucose，11.1。實驗分組:(1)正常組(control，n=8):K－H液持續(xù)灌流120 min;(2)缺血再灌注組(I/R group，n=11):以K－H液平衡15－20 min，37℃停灌45 min，再灌注60 min;(3)后適應(yīng)組(post，n=10):再灌前給予6個循環(huán)的30 s I/30 s R;(4)缺血再灌注后適應(yīng)+洛利普蘭組(post+roli 10μmol/L，n=8):以KH液平衡15 －20 min，改用含10μmol/L洛利普蘭的K－H液灌流10 min，停灌45 min，行后適應(yīng)處理并再灌注60 min;(5)缺血再灌注后適應(yīng)+SQ22536組(post+SQ22536，n=7):以 K－H液平衡15－20 min，改用含500 mmol/L SQ22536的K－H液灌流10 min，停灌45 min，行后適應(yīng)處理并再灌注60 min;(6)缺血再灌注+洛利普蘭組(I/R+roli，n=7):不行后適應(yīng)處理，余下過程同缺血再灌注后適應(yīng)+洛利普蘭組。

2．2 左室功能檢測 心臟復(fù)跳后，將一連接壓力換能器的球囊插入左心室，壓力換能器與PClab多導(dǎo)生理記錄儀相連，在電腦上連續(xù)記錄左室內(nèi)壓變化，并計算左室發(fā)展壓(left ventricular developed pressure，LVDP)=最大心室內(nèi)壓－最小心室內(nèi)壓。同時記錄冠脈流量(coronary flow，CF)。

2．3 組織病理學(xué)檢查 再灌60 min后取少許心臟組織4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下進行形態(tài)學(xué)檢查。

2．4 冠脈流出液酶學(xué)檢測 分別于停灌前、再灌流60 min時收集冠脈流出液以測定其中LDH和CK含量(按試劑盒說明操作)。

2．5 Total RNA抽提及 real－time PCR 再灌流60 min后取心肌組織，用Trizol試劑提取總RNA，取3μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用Primer 5.0引物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計。各基因引物序列如下:β－actin正義鏈 5'－AGAGGGAAATCGTGCGTGAC －3'，反義鏈5'－CCATACCCAGGAAGGAAGGCT－3';caspase－3正義鏈 5'－GGAGCAGAGCCATGGGCACG －3'，反義鏈5'－GCACAGACGCCCTGATGGGG －3';bax正義鏈5'－GGCCCACCAGCTCTGAACAG －3'，反義鏈5'－ GCAATCATCCTCTGCAGCTCCATATTA －3';bcl－2正義鏈5'－ TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC －3'，反義鏈 5'－ TGGAGAGCGTCAACAGGGAGATGTAC－3'。用Oligo dT18引物逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，實施實時熒光定量PCR反應(yīng)。以ΔCt表示目的基因與β－actin Ct值的差值、ΔΔCt表示對照組與處理各組 ΔCt的差值，2－ΔΔCt反映目的基因mRNA的相對含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，采用SPSS13.0軟件處理，組間顯著性檢驗采用單因素方差分析和LSD檢驗。

結(jié) 果

1 I/R對離體心臟的影響

將離體心臟37℃停灌30、40和45 min，以模擬在體心臟缺血缺氧。結(jié)果顯示隨著停灌時間的延長，LVDP恢復(fù)率隨之下降，分別由79.61%減至61.45%，54.15%和37.71%。停灌45 min時，CF也顯著減少(P＜0.05)，見圖2。冠脈流出液中LDH和CK分別由352.12 U/L和1.90 kU/L增至615.71 kU/L和2.61 kU/L(P＜0.05)。并且心肌組織內(nèi)凋亡調(diào)節(jié)基因caspase－3表達以及bax/bcl－2比值顯著增高，見圖5、6。組織病理學(xué)檢查顯示:I/R處理組心肌細胞排列雜亂，橫紋模糊不清或消失，細胞腫脹并出現(xiàn)明顯空泡樣變性、嗜酸性變及凝固性壞死，見圖7B。說明該離體心臟灌流模型可以模擬心肌I/R、具有可行性。

2 后適應(yīng)對離體I/R心臟功能的保護作用

再灌流60 min后將LVDP和CF進行比較，后適應(yīng)處理能顯著增加LVDP(圖1)和CF(圖2)。停灌前各組冠脈流出液中CK及LDH活性差異無顯著。后適應(yīng)處理能顯著降低冠脈流出液中CK及LDH活性(圖3和4)。檢測再灌流60 min后心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)基因，也得到相似結(jié)果，即后適應(yīng)處理能顯著降低心肌組織內(nèi)caspase－3 mRNA表達(圖5)和bax/bcl－2(圖6)比值。組織病理學(xué)檢查可見后適應(yīng)組部分空泡樣變性及嗜酸性變，但細胞損害程度明顯低于I/R組(圖7)。

Figure 1．Effects of different treatment on LVDP recovery rate．I/R:ischemia/reperfusion;post:postconditioning;roli:rolipram;SQ:SQ22536．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs I/R group;△P＜0.05 vs post group．圖1 不同處理對LVDP恢復(fù)率的影響

Figure 2．Effects of different treatment on coronary flow(CF)．Values were expressed as the percentages of CF measured during equilibrium．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs I/R group;△P ＜0．05 vs post group．圖2 不同處理對CF的影響

Figure 3．Effects of different treatment on LDH release into coronary artery flow．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖3 不同處理對心肌缺血再灌時冠脈流出液LDH釋放的影響

Figure 4．Effects of different treatment on CK release into coronary artery flow．ˉx±s．n=7－11．*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖4 不同處理對心肌缺血再灌時冠脈流出液CK釋放的影響

Figure 5．Effects of different treatment on caspase－3 mRNA expression in myocardium．ˉx±s．n=6．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖5 不同處理對心肌缺血再灌時心肌組織caspase－3 mRNA表達的影響

Figure 6．Effects of different treatment on bcl－2/bax ratio in myocardium．ˉx±s．n=6．*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs I/R group;△P ＜0.05 vs post group．圖6 不同處理對心肌缺血再灌時心肌組織bcl－2/bax的影響

3 cAMP參與后適應(yīng)對離體I/R心臟的保護作用

10μmol/L PDE4抑制劑洛利普蘭能顯著增強后適應(yīng)對心臟的保護作用，表現(xiàn)為:與后適應(yīng)組相比，LVDP顯著增高(圖1)及CF顯著增加(圖2)，冠脈流出液中LDH和CK活性均更為降低，見圖3、4。心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)基因檢測結(jié)果也顯示洛利普蘭能進一步增強后適應(yīng)的作用，即caspase－3 mRNA表達減少(圖5)、bax/bcl－2(圖6)比值降低。而 AC抑制劑SQ22536則能減弱/取消后適應(yīng)對心臟的保護作用，LVDP顯著降低(圖1)及CF顯著減少(圖2)，冠脈流出液中LDH和CK活性均增高(圖3、4)、心肌組織內(nèi)caspase－3 mRNA表達增加(圖5)、bax/bcl－2(圖6)比值上升。并且單用洛利普蘭則不能表現(xiàn)出心臟的保護作用，LVDP、CF、酶學(xué)指標和凋亡相關(guān)基因結(jié)果均顯示與I/R組無顯著差別。組織病理學(xué)檢查可見后適應(yīng)與洛利普蘭共同處理能減輕心肌組織變性及其它病理改變程度，而后適應(yīng)與SQ22536共同處理則組織損害程度重于后適應(yīng)組，見圖7。

討 論

缺血再灌注被認為是多因素參與、非抗原依賴性的炎癥反應(yīng)過程。臨床上，心肌I/R常常引起心律失常、心肌頓抑、心肌冬眠、無復(fù)流、心肌細胞損傷、LDH及CK釋放增加和心功能障礙等病理生理變化［3］。本研究顯示，對 Langendorff心臟灌流［4］進行停灌/復(fù)流處理，使其出現(xiàn)了LVDP降低和CF減少、心肌LDH和CK釋放增加、凋亡/抗凋亡基因表達異常、組織病理學(xué)變化，并且凋亡基因mRNA表達增高、抗凋亡基因表達降低。這些結(jié)果均與前人一致，說明該離體心臟灌流模型可以用來模擬心肌I/R。

Figure 7．The pathological examination of myocardium in different groups(HE staining，×l00)．A:control;B:I/R;C:post;D:post+roli;E:post+SQ;F:I/R+roli．圖7 各處理組心臟組織學(xué)改變

缺血后適應(yīng)是一種在心肌再灌注時進行干預(yù)的保護措施，2003年Zhao等［5］首次報道了這種干預(yù)可導(dǎo)致心臟梗塞面積減少。隨后大量研究在其它種屬的動物如大鼠［6］、小鼠［7］及家兔［8］也證明了缺血后適應(yīng)具有保護心臟的能力，甚至在臨床實施經(jīng)皮冠脈介入治療的病人實行數(shù)次短暫的球囊擴張也能夠減輕缺血損傷并改善心肌的灌注。目前對于缺血后適應(yīng)介導(dǎo)心臟保護的機制尚未完全弄清。本研究采用了特異性PDE4抑制劑洛利普蘭和AC抑制劑SQ22536兩個工具藥來觀察cAMP在后適應(yīng)介導(dǎo)心臟保護機制中的作用。結(jié)果顯示洛利普蘭能進一步地增強后適應(yīng)的保護作用，而SQ22536則抑制了該保護作用。另一方面，洛利普蘭在沒有進行后適應(yīng)干預(yù)時并未表現(xiàn)出其保護I/R心臟的作用，也說明了并不是由于cAMP自身濃度增高發(fā)揮作用的，該結(jié)果與前人研究理論一致，即PDE4抑制劑只有在心肌受刺激的狀態(tài)下影響心肌興奮性，而單獨應(yīng)用其并不能保護缺血心?。?］。而后適應(yīng)這種保護性刺激在cAMP濃度改變時作用增強或減弱，說明cAMP確實參與了后適應(yīng)對I/R心臟的保護機制。

關(guān)于I/R引起的心肌細胞凋亡最初見于1994年Gottlieb等［10］的報道，隨后越來越多的動物實驗和臨床病理標本均證實I/R導(dǎo)致細胞凋亡的產(chǎn)生。也有不同研究發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)、缺血后適應(yīng)均表現(xiàn)出一定的抗心肌細胞凋亡效應(yīng)［11，12］。細胞凋亡過程的分子調(diào)控機制非常復(fù)雜，其中bcl－2基因具有抗凋亡作用，而bax基因則可對抗Bcl－2蛋白抗凋亡的作用，細胞中bax和bcl－2 mRNA比值決定了細胞是否發(fā)生凋亡。Caspase－3位于Bcl－2和Bax的下游，是凋亡事件的最終效應(yīng)酶，有研究表明它在心肌I/R損傷中發(fā)揮著非常重要的作用。因此本研究中主要對caspase－3 mRNA表達情況和bax/bcl－2比值進行觀察，并且再次證實了缺血后適應(yīng)具有抗心肌細胞凋亡并改善心功能的作用。而且采用洛利普蘭能增強后適應(yīng)的抗凋亡作用，而SQ22536能抑制該作用，因此認為cAMP信號分子參與了后適應(yīng)調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡信號的機制，即后適應(yīng)通過增加該信號組分抗凋亡、保護心肌。

［1］ Hausenloy DJ，Yellon DM．Preconditioning and postconditioning:underlying mechanisms and clinical application［J］．Atherosclerosis，2009，204(2):334 －341．

［2］ Szekeres L．Drug－induced delayed cardiac protection against the effects of myocardial ischemia［J］．Pharmacol Ther，2005，108(3):269 －280．

［3］ Skyschally A，Schulz R，Heusch G．Pathophysiology of myocardial infarction:protection by ischemic pre－ and postconditioning［J］．Herz，2008，33(2):88 － 100．

［4］ Vidavalur R，Swarnakar S，Thirunavukkarasu M，et al．Ex vivo and in vivo approaches to study mechanisms of cardioprotection targeting ischemia/reperfusion(I/R)injury:useful techniques for cardiovascular drug discovery［J］．Curr Drug Discov Technol，2008，5(4):269 －278．

［5］ Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al．Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):H579－H588．

［6］ Pinheiro BB，F(xiàn)iorelli AI，Gomes OM，et al．Cardiac effects of postconditioning depend critically on the duration of reperfusion and reocclusion episodes［J］．Heart Surg Forum，2010，13(1):E52－E56．

［7］ Kaljusto ML，Rutkovsky A，Stenslokken KO，et al．Postconditioning in mouse hearts is inhibited by blocking the reverse mode of the sodium － calcium exchanger［J］．Interact Cardiovasc Thorac Surg，2010，10(5):743 －748．

［8］ Donato M，D'Annunzio V，Buchholz B，et al．Role of matrix metalloproteinase－2 in the cardioprotective effect of ischaemic postconditioning［J］．Exp Physiol，2010，95(2):274－281．

［9］ Rao YJ，Xi L．Pivotal effects of phosphodiesterase inhibitors on myocyte contractility and viability in normal and ischemic hearts［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30(1):1－24．

［10］ Gottlieb RA，Burleson KO，Kloner RA，et al．Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes［J］．JClin Invest，1994，94(4):1621 －1628．

［11］ Sun H，Guo T，Liu L，et al．Ischemic postconditioning inhibits apoptosis after acute myocardial infarction in pigs［J］．Heart Surg Forum，2010，13(5):E305－E310．

［12］ Cheng Y，Zhu P，Yang J，et al．Ischaemic preconditioning－regulated miR－21 protects heart against ischaemia/reperfusion injury via anti－apoptosis through its target PDCD4［J］．Cardiovasc Res，2010，87(3):431 －439．