張德太， 張 科， 楊 文， 胡麗華

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢430022)

低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia－inducible factor－1，HIF－1)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。HIF－1 由α 和β 兩個(gè)亞基組成，HIF－1α 是調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，在許多腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤高侵襲性、易轉(zhuǎn)移、對(duì)放化療不敏感和預(yù)后不良密切相關(guān)［1］。

HIF－1α 在常氧條件下能通過脯氨酰羥化作用而迅速降解，半衰期不到5 min［2］。低氧狀態(tài)時(shí)，HIF－1α 降解途徑被阻斷。研究表明，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide－adenine dinucleotide phospate，NADPH)依賴的細(xì)胞色素P－450 還原酶(NADPH cytochrome P－450 reductase，NPR)不僅介導(dǎo)了缺氧環(huán)境下HIF－1α 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且在維持其穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用;NADPH 作為NPR 的底物，可能在此過程中扮演重要角色［3］。葡萄糖－6－磷酸脫氫酶(glucose－6－phosphate dehydrogenase，G6PD)是磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway，PPP)的關(guān)鍵酶，主要作用是提供體內(nèi)NADPH，在許多腫瘤細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)G6PD 高表達(dá)并且與某些生物學(xué)特性密切相關(guān)［4－6］。那么，是否能通過阻抑腫瘤細(xì)胞G6PD 的同時(shí)下調(diào)HIF－1α，達(dá)到協(xié)調(diào)干預(yù)瘤細(xì)胞的缺氧反應(yīng)呢?目前尚缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本文將對(duì)此展開研究。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和菌株 人結(jié)腸癌細(xì)胞株(LoVo)購自中國科學(xué)院。含有綠色熒光蛋白、耐卡那霉素基因、抗新霉素基因及人U6 啟動(dòng)子的質(zhì)粒pEGFPC1－U6 和大腸桿菌DH5α 均購自武漢晶賽公司。

1.2 主要試劑與工具酶 胎牛血清(FBS)購自Gibco;兔抗人HIF－1α 抗體購自R＆D;兔抗人β－actin抗體和蛋白質(zhì)印跡化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgGⅡ抗購于武漢博士德公司;PVDF 膜購自PALL;DL－2000 marker 和瓊脂糖膠回收試劑盒為TaKaRa 產(chǎn)品，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000 購自Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑與T4 連接酶、Taq 酶及各種限制性內(nèi)切酶均購自Promega ;質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司;葡萄糖－6－磷酸二鈉鹽(G6P·Na2)、氧化型輔酶II(NADP)均為Sigma 產(chǎn)品;NADPH 定量試劑盒購自上海越研生物科技公司。

1.3 儀器 引物設(shè)計(jì)軟件為Primer 5.0，電泳儀為北京六一產(chǎn)品，可見－紫外分光光度計(jì)為Shimadzu產(chǎn)品，超聲粉碎勻漿器由寧波新芝科器研究所生產(chǎn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及低氧處理 人結(jié)腸癌細(xì)胞株(Lo-Vo)用含有10%胎牛血清、適當(dāng)非必需氨基酸和丙酮酸的DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2－3 d 傳代1 次，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶(含0.1%EDTA)進(jìn)行消化。細(xì)胞生長至次融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行低氧處理:以去氣泡培養(yǎng)液換液，置細(xì)胞于充入5% CO2及90%氮?dú)?氧氣濃度為5%)的37℃孵箱中培養(yǎng)36 h。

2.2 siRNA 序列的設(shè)計(jì) 從GenBank 中查找人G6PD mRNA 序列(NM－000402)，參照文獻(xiàn)［7，8］設(shè)計(jì)出2 條特異性的siRNA 寡核苷酸序列(分別為siRNA1 和siRNA2)，利用RNA Structure 軟件分析其mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行BLAST 同源性分析。其中，siRNA1:正 義 鏈 5'－GATCCCGCCTCAGTGCCACTTGACATTGATATCCGTGTCAAGTGGCACTGAGGCTTT-TTTCCAAC－3'，反義鏈5'－TCGAGTTGGAAAAAAGCCTCAGTGCCACTTGACACGGATATCAA-TGT CAAGTGGCACTGAGGCGG－3';siRNA2:正義鏈 5'－GATCCCCGTGAGAGAATCTGCCTGTTTGATATCCGACAGGCAGATTCTCTCACGTTTTTTCCAAC－3'， 反 義 鏈 5'－TCGAGTTGGAAAAAACGTGAGAGAATCTGCCTGTCGGATATCAAACAGGCAGATTCTCTCACGGG－3'。同時(shí)選取1 對(duì)與人G6PD 基因序列完全沒有同源性的siRNA 寡核苷酸序列作為陰性對(duì)照，均送上海生物工程有限公司合成。

2.3 載體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將pEGFP－C1－U6質(zhì)粒和合成的siRNA 用足量的BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切消化，低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后回收大片段;將上述回收片斷在T4 連接酶作用下，22 ℃連接反應(yīng)過夜;各取2 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂布于含卡那霉素抗性的LB 平皿上，37 ℃恒溫過夜，從平皿中各挑選3 個(gè)單克隆菌落于3 mL 含卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)液中，37 ℃、270 r/min 搖床培養(yǎng)過夜;用質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，并做PstⅠ酶切鑒定，挑選鑒定正確的克隆進(jìn)行DNA 測(cè)序分析。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 應(yīng)用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體載體介導(dǎo)方法將pEGFP－C1－U6/ G6PD 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至LoVo 細(xì)胞。將細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)，取兩個(gè)6孔板鋪板:1－3 孔為轉(zhuǎn)染pEGFP－C1－U6/ G6PD質(zhì)粒的LoVo 細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組)，4－6 孔為轉(zhuǎn)染pEGFP－C1－U6/ UC 質(zhì)粒的LoVo 細(xì)胞(質(zhì)粒對(duì)照組)，7－9 孔為未做任何轉(zhuǎn)染處理的LoVo 細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染組)。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用G418 進(jìn)行逐步篩選，篩選8 周后獲得穩(wěn)定克隆。

2.5 RT－PCR 檢測(cè)干擾效率 將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞在缺氧環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞并以冷PBS 清洗后采用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞總RNA，用Oligo(dT)18及M－MLV 將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，G6PD 的擴(kuò)增引物為正義鏈5'－AGCAGACGAGAAGCCCAAGC－3'，反義鏈5'－AGGATGACGCAGGCGATG－3'，擴(kuò)增條件為94 ℃45 s，63 ℃40 s，72 ℃40 s，擴(kuò)增產(chǎn)物為432 bp。

2.6 細(xì)胞內(nèi)G6PD 活性及NADPH 測(cè)定 將細(xì)胞用PBS 清洗后在冷裂解緩沖液(50 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，1% Triton X－100，100 mg/L PMSF，5 mg/L leupeptin，5 mg/L aprotin)中0 ℃裂解30 min，10 000 r/ min 離心15 min。取上清采用Bradford 法進(jìn)行蛋白定量，參照文獻(xiàn)［8］，用紫外分光光度法測(cè)定340 nm 時(shí)一定量總蛋白中G6PD 在單位時(shí)間內(nèi)將NADP+轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH 的量來確定G6PD酶活性，單位以U/g 蛋白表示。參照試劑盒說明進(jìn)行NADPH 定量測(cè)定。

2.7 檢測(cè)HIF－1α mRNA 表達(dá) 將轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染組的LoVo 細(xì)胞分別進(jìn)行缺氧培養(yǎng)36h，收集細(xì)胞按前述處理方法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，HIF－1α 擴(kuò)增的上游引物為5'－GCAAGACTTTCCTCAGTCGACACA－3'，下游引物5'－GCATCCTGTACTGTCCTGTGGTGA－3'，擴(kuò)增片段長度207 bp，同時(shí)設(shè)β－actin為內(nèi)參照，擴(kuò)增的上游引物為5’－ TCCATCATGAAGTGTGACGT－ 3’，下游引物為5’－TACTCCTG CTTGCTGATCCAC－ 3’擴(kuò)增片段長度245 bp。擴(kuò)增體系為:10 × buffer 2.0 μL，dNTPs (10 mmol/L)0.5 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，Taq 酶1U，BSA (1 g/L )1.0 μL，cDNA 模板1.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)3.5 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。HIF－1α 的擴(kuò)增條件:94 ℃45 s，58 ℃40 s，72 ℃40 s;β－actin 的擴(kuò)增條件為94 ℃45 s，63 ℃40 s，72 ℃40 s。擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及EB 染色，暗室中用紫外透射儀檢查并攝影。

2.8 檢測(cè)HIF－1α 蛋白表達(dá) 分別將轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染組的LoVo 細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞離心去上清，以冷PBS 洗滌2 次。細(xì)胞沉淀用0.5 mL 細(xì)胞裂解緩沖液［組成:1 mol/ L Tris－HCl (pH 8.0)，0.15 mol/ L NaCl ，1.0 % Triton X－100，100 mg/L PMSF］重懸，置冰上搖床30 min后，于4 ℃、12 000 r/ min 離心5 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取25 μg 蛋白樣品經(jīng)10 %SDS－PAGE，120 V 80 min 電泳分離總蛋白，以半干式電轉(zhuǎn)儀100 V 80 min轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜。膜用含5 %脫脂奶的PBST 室溫孵育1 h 后加入兔抗人多克隆HIF－1α 抗體(稀釋度1∶250)，β－actin Ⅰ抗(稀釋度1∶400)，4 ℃雜交過夜。次日洗膜3 次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗(稀釋度1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBS 漂洗，應(yīng)用ECL 試劑盒行發(fā)光反應(yīng)，圖像掃描分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 siRNA 重組子的鑒定

pEGFP－C1－U6 質(zhì)粒有PstⅠ的酶切位點(diǎn)，能夠被PstⅠ所酶切，而經(jīng)BamH I 和Xho Ⅰ酶切后，中間插入目的序列后PstⅠ酶切位點(diǎn)被取代，故重組質(zhì)粒不能被PstⅠ所切開。再用SalⅠ和Xho Ⅰ雙酶切，經(jīng)電泳分析，構(gòu)建成功的質(zhì)粒均被切出1 條400 bp大小的DNA 帶，見圖1。經(jīng)酶切后，挑取鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒siRNA 序列與設(shè)計(jì)的片段完全一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Figure 1. Identification of recombinant plasmids by restriction endonuclease SalⅠand XhoⅠ. M:DL2000 marker;1，2，3:recombinant plasmids were digested with SalⅠand XhoⅠ.圖1 重組質(zhì)粒SalⅠ+ XhoⅠ雙酶切后電泳結(jié)果

2 重組質(zhì)粒篩選

取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(siRNA1 和siRNA2)、質(zhì)粒對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組的LoVo 細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)36 h后提取RNA，RT－PCR 檢測(cè)G6PD mRNA 表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的G6PD mRNA 的表達(dá)豐度為1.0，其它細(xì)胞與其對(duì)比分析。轉(zhuǎn)染siRNA1 的LoVo細(xì)胞G6PD mRNA 的相對(duì)表達(dá)豐度為0.57，轉(zhuǎn)染siRNA2 的相對(duì)表達(dá)豐度為0.76，見圖2，故選用轉(zhuǎn)染siRNA1 的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2. Effect of RNA interference on G6PD mRNA expression. 1，non－transfection:no plasmid transfection;2，control:empty plasmid transfection;3，siRNA1:siRNA1 plasmid transfection;4，siRNA2:siRNA2 plasmid transfection. ±s. n=3. * P ＜0.05 vs nontransfection.圖2 轉(zhuǎn)染siRNA 對(duì)G6PD mRNA 表達(dá)的干擾效率

3 siRNA 對(duì)G6PD 活性的影響

選擇質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(siRNA1)、質(zhì)粒對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染組的LoVo 細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)36 h 后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)G6PD 活性。siRNA 沉默G6PD 基因后其活性與未轉(zhuǎn)染組和質(zhì)粒對(duì)照組比較有顯著下降(P ＜0.05)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)照組的細(xì)胞G6PD 活性與未轉(zhuǎn)染組無明顯變化，見圖3。

Figure 3. Effect of RNA interference on G6PD activity. Non－transfection:no plasmid transfection;control:empty plasmid transfection;siRNA1:siRNA1 plasimid transfection.±s. n=3. * P ＜0.05 vs non－transfection.圖3 siRNA 對(duì)G6PD 活性的影響

4 siRNA 沉默G6PD 基因?qū)Π麅?nèi)NADPH 水平的影響

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(siRNA1)、質(zhì)粒對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組的LoVo 細(xì)胞在缺氧條件下培養(yǎng)36 h 后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)NADPH 水平，以未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NADPH 水平為參照。siRNA 沉默G6PD 基因的LoVo 細(xì)胞缺氧處理36 h后胞內(nèi)NADPH 水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著下降(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組無明顯變化，見圖4。

Figure 4. Effect of RNA interference on NADPH concentration in LoVo cells. Non－transfection:no plasmid transfection;control:empty plasmid transfection;siRNA1:siRNA1 plasmid transfection. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs non－transfection.圖4 siRNA 沉默G6PD 基因?qū)Π麅?nèi)NADPH 水平的影響

5 G6PD 沉默對(duì)LoVo 細(xì)胞內(nèi)HIF－1α mRNA 的影響

siRNA 沉默G6PD 基因的LoVo 細(xì)胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h 后經(jīng)RT－PCR 檢測(cè)，HIF－1α mRNA 表達(dá)水平無明顯改變，見圖5。

Figure 5. Effect of RNA interference on HIF－1α mRNA expression in LoVo cells by RT－PCR. 1，siRNA1:siRNA1 plasmid transfection;2，control:empty plasmid transfection;3，non－transfection:no siRNA plasmid transfection. ±s. n=3.圖5 G6PD 沉默對(duì)LoVo 細(xì)胞內(nèi)HIF－1α mRNA 的影響

6 G6PD 沉默對(duì)HIF－ 1α 蛋白水平的影響

siRNA 沉默G6PD 基因的LoVo 細(xì)胞在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)36 h 后經(jīng)Western blotting 檢測(cè)，HIF－1α 蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有顯著下降，見圖6。

Figure 6. Effect of RNA interference on HIF－1α protein expression. 1，siRNA1:siRNA1 plasmid transfection;2，control:empty plasmid transfection;3，non－transfection:no plasmid transfection. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs non－transfection.圖6 G6PD 沉默對(duì)HIF－ 1α 蛋白水平的影響

討 論

HIF－1 在缺氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，HIF－1α 是其唯一的氧調(diào)節(jié)亞基，它決定HIF－1 的活性［9］。當(dāng)氧分壓降低或其它因素起調(diào)節(jié)作用時(shí)，HIF－1α 降解途徑被阻斷，HIF－1α 在核內(nèi)聚集，并與β 亞基形成有活性的異二聚體HIF－1 ，再與下游靶基因上的缺氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合，調(diào)控下游百余種靶基因轉(zhuǎn)錄，在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、促進(jìn)細(xì)胞增殖與存活、抑制凋亡、促進(jìn)血管發(fā)生等方面具有重要的作用［10］。HIF－1α 不僅在腫瘤的局部和轉(zhuǎn)移灶中高表達(dá)，而且與腫瘤的分化特性、演進(jìn)過程、侵襲、轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后狀況直接有關(guān)，針對(duì)腫瘤多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑瘤劑大多間接抑制了HIF－1 的作用［11，12］。因此，HIF－1α 已成為腫瘤治療中的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

也有研究表明，調(diào)控G6PD 能顯著改變瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，因此G6PD 是腫瘤防治中的一個(gè)有價(jià)值的候選基因［13，14］?？紤]到通過NADPH 可以將G6PD 與HIF－1α 直接聯(lián)系起來，故本研究選擇通過siRNA 技術(shù)沉默G6PD 基因觀察其對(duì)另一個(gè)重要的腫瘤治療靶點(diǎn)HIF－1α 的影響。

本文結(jié)果顯示，靶向G6PD 基因的siRNA 能有效沉默G6PD，其mRNA 表達(dá)水平下降43%，酶活性下降63.5%。G6PD 基因沉默也直接影響到NADPH的生產(chǎn)效率，瘤細(xì)胞內(nèi)NADPH 水平較未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有十分顯著的下降(41% vs 100%，P ＜0.05)。

另一方面，本研究也觀察到G6PD 基因沉默后的LoVo 細(xì)胞經(jīng)過缺氧處理后HIF－1α mRNA 表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，但HIF－1α 蛋白水平有顯著下降。因此，G6PD 影響HIF－1α 水平可能不是通過基因表達(dá)方式而更可能是通過改變HIF－1α 的穩(wěn)定性完成的，結(jié)合G6PD 對(duì)胞內(nèi)NADPH 水平的調(diào)節(jié)作用，我們認(rèn)為NADPH 水平可能是導(dǎo)致HIF－1α 穩(wěn)定性下降的一個(gè)重要原因。當(dāng)然也不排除G6PD 基因沉默影響到HIF－1α 蛋白的表達(dá)效率，這將是下一步需要研究的問題。

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