王斌 韓朝 遲放魯 田潔

·基礎(chǔ)研究·

糖皮質(zhì)激素受體在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對其表達的影響

王斌 韓朝 遲放魯 田潔＊

目的研究糖皮質(zhì)激素受體(GR)在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對豚鼠耳蝸GR表達的影響。方法將豚鼠隨機分為2組：實驗組豚鼠在強度115 dB SPL的白噪聲中暴露3 h。暴露結(jié)束后2 h，斷頭取耳蝸。對照組豚鼠不做處理，取耳蝸。制備耳蝸冷凍切片，采用免疫熒光技術(shù)觀察豚鼠耳蝸的GR表達情況，并進行熒光強度半定量分析。結(jié)果①豚鼠耳蝸GR主要的陽性部位：螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋緣、Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)。螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋緣及螺旋神經(jīng)節(jié)等區(qū)域的GR熒光強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)，上述各區(qū)域的GR熒光強度與Corti器的GR熒光強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。②聲損傷后，豚鼠耳蝸的GR熒光強度在骨螺旋緣、Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)；螺旋韌帶、血管紋區(qū)域熒光強度較對照組明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.01)。結(jié)論GR分布于豚鼠耳蝸的螺旋韌帶、血管紋、Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)，其中螺旋韌帶、血管紋表達最強，Corti器表達最弱；聲損傷降低耳蝸各區(qū)域GR的表達，以血管紋、螺旋韌帶最明顯。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：86-89)

糖皮質(zhì)激素受體；耳蝸；聲損傷；豚鼠

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)主要通過被動擴散的方式結(jié)合于糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)，激素-受體復(fù)合物最終進入細胞核影響蛋白的合成代謝。因此GC的作用需要GR的介導(dǎo),而內(nèi)耳GR可能是應(yīng)激時有用的標志物[1]。已有學(xué)者[2]應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme link immunosorbent assay,ELISA)、原位雜交、免疫組織化學(xué)方法研究GR在內(nèi)耳的表達，同時應(yīng)用分子生物學(xué)的方法研究噪聲對豚鼠內(nèi)耳GR mRNA水平的影響，但是直觀地觀察噪聲暴露后豚鼠內(nèi)耳GR的分布及表達變化尚罕見報道。我們利用免疫熒光技術(shù)初步觀察GR在豚鼠耳蝸的分布及聲損傷對豚鼠內(nèi)耳GR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 儀器：丹麥Brüel amp; Kjr 1405型噪聲發(fā)生器，德國Sartorius公司BS224S型電子分析天平，德國Sartorius公司PB-10型pH計，德國Leica公司冷凍切片機，德國Leica公司MPS30熒光倒置顯微鏡，德國Leica公司連續(xù)變倍體視顯微鏡。試劑：兔抗豚鼠GR抗體(Abcam公司)，羊抗兔IgG-TRITC(華美生物工程公司)。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 動物及分組 健康純白紅目豚鼠36只，耳廓反射正常,體質(zhì)量200～250 g，雌雄不拘。由上海市實驗動物中心提供。隨機分為實驗組與對照組，每組18只。實驗組予噪聲暴露，暴露結(jié)束后2 h斷頭取耳蝸。正常對照組不做處理，取耳蝸。

1.3 方法

1.3.1 噪聲暴露 將動物置于通風(fēng)良好的小型隔音箱內(nèi)(箱壁由雙層鋼板組成，中間填充泡沫隔音材料)，箱內(nèi)背景噪聲40 dB SPL。噪聲由噪聲發(fā)生器(Bamp;K 1405)產(chǎn)生，經(jīng)功率放大器(FJG600-1)放大后，輸入揚聲器。揚聲器置于箱內(nèi)側(cè)壁和頂壁。用 4145微型話筒連接 Bamp;K2610頻率放大器監(jiān)測聲壓，測試系統(tǒng)用124 dB活塞發(fā)生器校準。隔音箱內(nèi)任何點聲壓均勻度誤差不超過±1 dB。噪聲為白噪聲，強度為115 dB SPL，暴露時間3 h。

1.3.2 豚鼠耳蝸冷凍切片的制備 將豚鼠快速斷頭取雙側(cè)聽泡。取耳蝸，置于預(yù)冷的4%多聚甲醛中。打開圓窗、前庭窗(卵圓窗)及蝸尖，用吸管從蝸尖處向耳蝸內(nèi)灌流固定液，將耳蝸置于該固定液中4 ℃ 4 h以上。然后用磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)沖洗耳蝸并放入10%乙二胺四乙酸鈉脫鈣10 d，每天換脫鈣液。PBS沖洗后，將標本依次移入10%、15%、20%蔗糖PBS中進行梯度脫水。而后置于最佳切削溫度包埋劑中包埋過夜，平行于耳蝸縱軸行8 μm恒冷冷凍切片。將切片貼于已經(jīng)涂膠(多聚賴氨酸)處理的載玻片上，以備免疫熒光染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件分析所獲得的數(shù)據(jù)，單因素方差分析比較耳蝸不同區(qū)域熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 GR在豚鼠耳蝸的分布 觀察對照組的36耳切片，GR陽性細胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光，且在豚鼠耳蝸各個部位均有不同程度染色，主要位于螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋緣、Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)(附4頁圖1)。

選擇圖像的一定區(qū)域進行耳蝸GR熒光強度的測量。對螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋緣、Corti器及螺旋神經(jīng)節(jié)等每個區(qū)域選擇2個部位，采用計算機自帶掃描分析軟件測定熒光強度，對收集的熒光倒置顯微鏡圖像進行熒光半定量分析，對非特異性的背景染色熒光強度也進行測量。由于每張切片的特定區(qū)域(如螺旋韌帶)，熒光的陽性區(qū)域強度基本一致，但是特定區(qū)域之間(如螺旋韌帶與Corti器之間)熒光強度相差較大；所以在對每一特定區(qū)域(如螺旋韌帶)中選取2個部位時，選取有陽性熒光的區(qū)域即可。GR的熒光強度減去背景熒光強度即為該區(qū)域GR表達的平均熒光強度。不同區(qū)域熒光強度的比較，間接反映了不同區(qū)域GR的表達情況。螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋緣以及螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域GR熒光強度無明顯差別，上述各區(qū)域與Corti器的GR熒光強度差別明顯(附4頁圖2)。

2.2 聲損傷對豚鼠耳蝸GR表達的影響 觀察噪聲暴露組的36耳切片，與對照組豚鼠耳蝸GR組織分布區(qū)域一致，在螺旋韌帶、血管紋、骨螺旋緣、Corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)均可見GR表達呈現(xiàn)的紅色熒光，但是螺旋韌帶、血管紋區(qū)域熒光強度明顯減低(附4頁圖3～5，封三圖6)。

對照組及實驗組耳蝸各區(qū)域GR表達經(jīng)圖像分析，進行耳蝸GR熒光強度測量。正常組與聲損傷組不同區(qū)域熒光強度的比較，間接反映了聲損傷對豚鼠耳蝸GR表達的影響。骨螺旋緣、Corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05),而螺旋韌帶、血管紋區(qū)域熒光強度較對照組明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，提示白噪聲115 dB SPL，連續(xù)暴露3 h對骨螺旋緣、Corti器以及螺旋神經(jīng)節(jié)GR的表達無明顯影響，卻顯著抑制了螺旋韌帶、血管紋區(qū)域GR的表達(封三圖7)。

3 討論

GC主要由腎上腺皮質(zhì)分泌,是機體重要的應(yīng)激激素和臨床上常用的抗感染、抗免疫反應(yīng)藥物,GR在其效應(yīng)的發(fā)揮過程中起著關(guān)鍵作用。GR和甲狀腺激素受體、維A酸受體、性激素受體等一樣,屬于核激素受體超家族成員,分布于除紅細胞以外的幾乎所有的有核細胞。 同時GR也是一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制。因此，GR一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點。

應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，GR在內(nèi)耳表達的分布具有不均衡性。運用組織化學(xué)原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠GR表達水平在螺旋韌帶最高,在血管紋和Corti器顯著低于螺旋韌帶。運用ELISA檢測人內(nèi)耳組織，證實GR在內(nèi)耳螺旋韌帶組織表達水平最高,其次是Corti器組織,而血管紋最低[3]。運用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測，豚鼠耳蝸GR的表達主要位于螺旋韌帶、血管紋、Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié),其中螺旋韌帶的III型纖維細胞表達水平最高[4]。本實驗運用免疫熒光技術(shù)進行檢測發(fā)現(xiàn)，正常豚鼠耳蝸GR分布于螺旋韌帶、血管紋、Corti器和螺旋神經(jīng)節(jié)，其中螺旋韌帶、血管紋表達最強，Corti器表達最弱，與上述結(jié)果基本一致。雖然應(yīng)用的方法(組織化學(xué)原位雜交、ELISA、免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫熒光技術(shù))不同，實驗的對象(大鼠、豚鼠、人)有所差異，定量檢測方法不一致(分子雜交、計算機圖片灰階分析、免疫熒光半定量分析)，研究結(jié)果提示，GR在不同部位的表達強度次序上略有差別；但是這些實驗結(jié)果的共性是GR在內(nèi)耳的分布具有不均衡性，螺旋韌帶表達最強。

在機體其他組織系統(tǒng)的研究顯示，GC靶組織中GR的數(shù)量決定了組織對GC的生物學(xué)反應(yīng)程度[5]。因此，GC對異源性內(nèi)耳組織的效應(yīng)與其GR的數(shù)量呈正相關(guān)。雖然本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù)不能對GR數(shù)量進行精確的定量分析，但是應(yīng)用計算機圖像分析軟件可對GR進行熒光強度半定量分析。不同區(qū)域間如果熒光強度差別具有統(tǒng)計學(xué)意義，則表明GR數(shù)量具有顯著差別。本實驗與既往研究相似，螺旋韌帶GR的表達最強。

螺旋韌帶區(qū)域存在3種纖維細胞，從上到下分別是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型纖維細胞。Shimazaki等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，這些纖維細胞均有GR表達，而以Ⅲ型纖維細胞最強。可以推測這些細胞對GC的生物學(xué)應(yīng)答最強。但是Ⅲ型纖維細胞的功能尚不清楚。最近推測，螺旋韌帶纖維細胞在耳蝸液體及離子平衡方面發(fā)揮作用。這種推測基于Na+-K+-ATP酶以及縫隙連接蛋白26(connexin 26，Cx26)的形態(tài)學(xué)觀察。位于Ⅱ型纖維細胞的Na+-K+-ATP酶提示，K+從底部細胞吸收進入螺旋韌帶纖維細胞，K+沿著Ⅰ型細胞及Ⅱ型細胞間的縫隙連接順濃度梯度進入血管紋底部及中間細胞。富含Na+-K+-ATP酶的血管紋邊緣細胞將K+泵入，之后沿著濃度梯度進入內(nèi)淋巴。實驗性內(nèi)淋巴積水、迷路炎、氣壓性中耳炎的耳蝸，在Ⅰ型及Ⅱ型纖維細胞中Cx26免疫染色減弱。這些發(fā)現(xiàn)提示，螺旋韌帶的纖維細胞與內(nèi)耳某些功能障礙有關(guān)，而螺旋韌帶纖維細胞中GR的表達提示，GC對于治療這些功能障礙可能有效。

研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸毛細胞GR表達不很顯著，但是鄰近的支持細胞也呈現(xiàn)GR陽性表達，提示GC治療并不完全直接作用于耳蝸感覺細胞。

基于以上發(fā)現(xiàn)，我們認為GR在耳蝸的表達是不均衡的，GC在耳蝸的不同區(qū)域會產(chǎn)生不同的效應(yīng)，針對多種內(nèi)耳疾病的受損區(qū)域完善GC治療的明確指征將成為可能。

應(yīng)激狀態(tài)下，比如過度的聲刺激，對內(nèi)耳GR表達的影響也得到一些學(xué)者關(guān)注。Terunuma等[2]將豚鼠分別暴露于2 kHz純音110、120、130 dB SPL聲強中10 min，在暴露后即刻,2、6、24 h應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測過度聲刺激對內(nèi)耳GR表達變化的影響，發(fā)現(xiàn)暴露于120 dB SPL即刻、2 h及暴露于130 dB SPL 2、6 h的豚鼠，耳蝸GR mRNA水平明顯下降。然而這一現(xiàn)象的確切機制尚不清楚。GR在耳蝸各區(qū)域分布不均衡，那么聲損傷后各區(qū)域GR的表達有什么變化呢？本實驗研究發(fā)現(xiàn)，115 dB SPL白噪聲暴露3 h，噪聲暴露結(jié)束2 h后螺旋韌帶和血管紋GR的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)，說明聲損傷后GR表達的減弱與耳蝸功能受抑制有關(guān)。

Rarey等[6]報道，經(jīng)噪聲暴露之后的大鼠，Corti器的GR明顯減少，而血清皮質(zhì)酮水平明顯升高，認為內(nèi)耳GR表達可能是內(nèi)耳組織對應(yīng)激反應(yīng)的有用標志物。先前的研究證實，血清GC能夠在培養(yǎng)的IM-9淋巴細胞和大鼠胰腺腺泡AR42細胞調(diào)節(jié)GR mRNA水平[7]。因此，有理由推論聲刺激提高了血清GC水平，下調(diào)了耳蝸GR mRNA水平。

Na+-K+-ATP酶主要分布于耳蝸血管紋的邊緣細胞、螺旋韌帶的II型纖維細胞以及緣上、紋上區(qū)域細胞；Ca2+-ATP 酶主要分布于螺旋韌帶的I型纖維細胞。Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP 酶對維持耳蝸正常功能發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露之后，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP 酶的活性明顯下降[8]，內(nèi)淋巴Ca2+顯著上升。因此，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP 酶活性減少將損害內(nèi)淋巴液的構(gòu)成，而且對感音神經(jīng)性聽力障礙發(fā)揮重要作用。在內(nèi)耳，血清GC水平的升高與螺旋韌帶和血管紋Na+-K+-ATP酶活性的降低有關(guān)[9]。因此作者認為，GC在調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶活性方面發(fā)揮作用，后者在過度聲刺激后活性降低。這些結(jié)果表明，GC對維持耳蝸離子平衡起重要作用，GR的表達水平可能影響內(nèi)耳的代謝系統(tǒng)。

雖然GC已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療快速進行性雙側(cè)內(nèi)耳功能障礙，如突發(fā)性聾、耳鳴、梅尼埃病、自身免疫性內(nèi)耳疾病等，但是目前對GC在內(nèi)耳的信號傳導(dǎo)通路知之甚少。在細胞水平，GC通過結(jié)合GR發(fā)揮效應(yīng)。GR是具有正性或負性調(diào)節(jié)某些基因能力的轉(zhuǎn)錄因子，屬于類固醇激素受體家族。GR在細胞質(zhì)中與伴侶蛋白結(jié)合在一起，保持其非激活形式。GC進入細胞，結(jié)合于GR。此時，GR與伴侶蛋白分離。2個激素受體結(jié)合物轉(zhuǎn)移入核內(nèi)。在細胞核內(nèi)，GR結(jié)合到GC反應(yīng)元件，調(diào)節(jié)GC的應(yīng)答基因[10]。下丘腦-垂體-腎上腺軸是中心的控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)，鏈接著中樞神經(jīng)系統(tǒng)和激素系統(tǒng)。下丘腦-垂體-腎上腺軸的元素包括下丘腦的室旁核，其神經(jīng)元合成和分泌加壓素和促皮質(zhì)釋放素，活化腎上腺GC的合成和釋放。因此，腎上腺皮質(zhì)釋放GC是由下丘腦和垂體調(diào)節(jié)的，由皮質(zhì)醇的量呈現(xiàn)負反饋機制。 動物暴露于噪聲時，一系列的生理和神經(jīng)內(nèi)分泌改變被激發(fā)，下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活導(dǎo)致GC的釋放。報道顯示，小鼠正常狀態(tài)下，皮質(zhì)類固醇的含量為10 ng/mL；聽力損傷停止后即刻(6～12 kHz，100 dB SPL，45 min)，皮質(zhì)類固醇水平升高15倍，之后快速恢復(fù)到正常水平[11]。

預(yù)先通過應(yīng)激激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，導(dǎo)致內(nèi)源性皮質(zhì)類固醇升高，或者給予外源性或者地塞米松，會對隨后的聽損傷具有保護作用。美替拉酮(皮質(zhì)類固醇合成阻滯劑)聯(lián)合RU486(GR拮抗劑)阻斷下丘腦-垂體-腎上腺軸會加重聽損傷后的聽力損失[12]，而地塞米松預(yù)處理對動物具有聽保護作用[11]。因此，本實驗的結(jié)果為臨床上應(yīng)用GC預(yù)防及治療內(nèi)耳疾患方面的研究提供了進一步的方向。

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2010-12-20)

(本文編輯 楊美琴)

試題1.答案：D。基質(zhì)性角膜炎病程中會引起角膜混濁、變薄、瘢痕、出血等，但不會引起角膜中央基質(zhì)層水腫。

試題2.答案：A。見于經(jīng)靜脈吸毒者的血管內(nèi)，會引起結(jié)晶樣視網(wǎng)膜病變。

試題3.答案：D。JCA按照起病和前6個月累及的關(guān)節(jié)范圍可分為3種類型：少數(shù)關(guān)節(jié)起病的JCA；多數(shù)關(guān)節(jié)起病的JCA；全身癥狀起病的JCA。見《臨床眼科學(xué)》(Jack J.Kanski著，第4版，徐國興譯)第272頁。

Distributionofglucocorticoidreceptorincochleaofguineapigsandtheeffectsofacoustictraumaonitsexpression

WANGBin，HANZhao，CHIFang-lu，TIANJie*.DepartmentofOtorhinolaryngology，EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity，Shanghai200031，China

Corresponding author：CHI fang-lu，Email：chifanglu@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the distribution of glucocorticoid receptor(GR) in cochlea of guinea pigs and the effects of acoustic trauma on its expression.MethodsAlbino guinea pigs were randomly divided into 2 groups:experimental group and control group.Noise exposure (white noise,115 dB SPL,3 h) was exerted in experimental group.Decapitation and cochlear separation was done 2 hours after noise exposure.Empty treatments were done in the control group.Frozen sections were prepared.Immunofluorescent technique fixing and fluorescence intensity semiquantitative analysis were detected for studying the distribution of GR in cochlea of guinea pigs and the effects due to the acoustic trauma.Results①The fundamental positive positions of GR were located in spiral ligament,stria vascularis,spiral limbus,organ of Corti and spiral ganglions.For fluorescence intensity of GR,there was no significant difference in spiral ligament,stria vascularis,spiral limbus and spiral ganglions(Pgt;0.05).However,there was significant difference between these positions and organ of Corti(Plt;0.05).② The fluorescence intensities of GR located in spiral limbus,organ of Corti and spiral ganglions were similar in noise exposure group and control group(Pgt;0.05).The fluorescence intensities of GR in spiral ligament,stria vascularis were much lower in noise exposure group (Plt;0.01).ConclusionsThe distribution of GR in cochlea of guinea pigs were located in spiral ligament,stria vascularis,spiral limbus,organ of Corti and spiral ganglions.The highest and least position were lateral wall and organ of Corti respectively.Acoustic trauma could decrease GR expression in all positions of cochlea,particularly in spiral ligament and stria vascularis.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:86-89)

Glucocorticoid receptor; Cochlea; Acoustic trauma; Guinea pigs

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科＊實驗中心上海 200031

遲放魯(Email:chifanglu@yahoo.com.cn)