宥永勝 沈麗君 秦華 高潮 范巍 劉洋 陳亦棋

·基礎研究·

后極部鞏膜層間鐵異物植入對兔眼生理生化的影響△

宥永勝 沈麗君 秦華 高潮＊范巍 劉洋 陳亦棋

目的通過兔眼電生理檢查及房水、玻璃體鐵離子濃度的檢測，評估后極部鞏膜層間鐵異物植入對兔眼生理生化的影響。方法選取健康成年日本大耳白兔12只，隨機分成兩組。以右眼為對照眼，左眼為實驗眼。制備2.0 mm×1.0 mm×0.2 mm中碳鐵片，經(jīng)眶路植入兔左眼后極部鞏膜板層內(nèi)。第一組植入無銹中碳鐵片，第二組植入有銹中碳鐵片。分別在植入前1周及術(shù)后1周、2周、1個月、3個月，對雙眼進行閃光視網(wǎng)膜電流圖(F-ERG)和閃光視覺誘發(fā)電位(F-VEP)檢查。在實驗結(jié)束處死前，抽取兔眼房水和玻璃體并設置空白對照，檢測其中的鐵離子濃度。運用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0，采用方差分析，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果暗視F-ERG混合反應a波振幅不同時間點之間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.885，P=0.129)，不同處理組之間比較差異也無統(tǒng)計學意義(F=1.188，P=0.340)；b波振幅差異無統(tǒng)計學意義(時間因素F=2.73，P=0.064；處理因素F=1.114，P=0.367)； F-VEP N1波潛時(時間因素F=1.605，P=0.263；處理因素F=1.556，P=0.314)、P1波潛時(時間因素F=2.329，P=0.092；處理因素F=2.186，P=0.103)差異均無統(tǒng)計學意義。房水鐵離子濃度各組差異有統(tǒng)計學意義(F=3.791，P=0.022)，其中有銹鐵片組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=3.32，P=0.004)。玻璃體鐵離子濃度各組差異有統(tǒng)計學意義(F=3.694，P=0.023)，其中有銹鐵片組與空白對照組(t=2.84，P=0.01)、無銹鐵片組與空白對照組(t=3.23，P=0.005)比較差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論在3個月實驗期內(nèi)，兔眼后極部鞏膜層間細小鐵異物無論氧化與否，均沒有對視網(wǎng)膜視神經(jīng)造成明確的電生理改變，但房水、玻璃體鐵離子濃度較鐵異物植入前有明顯升高。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：77-81)

鞏膜層間鐵異物；電生理檢查；鐵離子濃度；兔眼

鐵是異?；钴S的金屬，在眼外傷患者中鐵異物傷占據(jù)很大的比例，給眼球的結(jié)構(gòu)和功能造成很大的損害。臨床上偶爾會碰到一些赤道后鞏膜層間鐵異物傷患者，因為異物未穿透鞏膜全層，對玻璃體、視網(wǎng)膜等眼內(nèi)組織未造成直接損傷，故該類患者往往視力較好，也無明顯不適。由于異物毗鄰視神經(jīng)，手術(shù)取出難度較大，且容易損傷視神經(jīng)。此異物是否需要早期手術(shù)取出及何時取出等目前尚存有很大爭議，由于缺乏理論依據(jù)，結(jié)果不一而終。本課題是模擬該類眼外傷患者，通過動物實驗簡單揭示后極部鞏膜層間鐵異物對眼球生理生化產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康成年日本大耳白兔12只，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限(有孕雌兔除外)。編號后采用隨機數(shù)據(jù)表隨機分成2組，每組6只：第1組為無銹鐵片組；第2組為有銹鐵片組。第1組術(shù)中將無銹鐵片置入兔左眼后極部鞏膜板層內(nèi)，第2組是將無銹鐵片氧化生銹后植入兔左眼同樣位置，以右眼作對照。實驗結(jié)束時，購置日本大耳白兔3只，作為鐵離子濃度檢測的空白對照組。

1.2 后極部鞏膜層間鐵異物動物模型的建立 實驗動物肌內(nèi)注射速眠新II代注射液(0.2 mL/kg)，2 min后，腹腔注射10%水合氯醛(1 mL/kg)。待其肌肉松弛，角膜反射、疼痛反射基本消失后，進行如下操作：①兔左眼結(jié)膜囊滴入0.5%愛爾卡因滴眼液2次，開瞼器開瞼，鹽酸林可霉素滴眼液沖洗結(jié)膜囊；②手術(shù)顯微鏡下，鼻側(cè)角鞏膜緣縫線牽引，剪開鼻側(cè)球結(jié)膜，斷開內(nèi)直肌，充分暴露后極部鞏膜；③距角膜緣8 mm做2 mm×2 mm板層鞏膜瓣；④鞏膜瓣下植入制備好的2.0 mm×1.0 mm×0.2 mm無銹中碳鐵片，8-0可吸收縫線縫合鞏膜瓣4針固定異物；⑤縫合內(nèi)直肌及球結(jié)膜。同法植入有銹中碳鐵片。術(shù)后給予妥布霉素滴眼液，3次/d，預防感染。 為了明確鐵異物是否植入兔眼后極部鞏膜內(nèi)，術(shù)后采用眼眶CT掃描、眼部B超驗證(附2頁圖1和圖2)。

1.3 電生理檢測 應用ROLAND多功能視覺電生理記錄系統(tǒng)。視網(wǎng)膜電圖 (flash electroretinogram，F(xiàn)-ERG) 主要器材：ERG-jet金箔角膜接觸鏡電極2只，不銹鋼針電極2個。電極安放：角膜接觸鏡電極內(nèi)滴入人工淚液作為耦合劑，分別置于兩眼角膜正中，兩根參考電極分別置于前額正中和左耳尖皮下。記錄參數(shù)：通頻帶寬1～300 Hz，刺激強度1.6 log·cd·s·m-2，記錄時間250 ms，單次閃光記錄。視覺誘發(fā)電位(flash visual evoked potential，F(xiàn)-VEP) 主要設備器材：不銹鋼針電極3個。電極安放：記錄電極置于兩耳跟連線中點處骨膜下，參考電極置于兩眼連線中點處骨膜下,接地電極置于同側(cè)耳尖皮下。記錄參數(shù)：通頻帶寬5～100 Hz，間隔1 s閃光1次，刺激強度1.6 log·cd·s·m-2，疊加50次。

實驗方法：①麻醉成功后安裝電極(麻醉方法同上)，先行鐵異物眼F-VEP檢測并記錄數(shù)據(jù)，再檢測對照眼；②復方托吡卡胺滴眼液滴雙眼散瞳，暗室內(nèi)加蓋遮光布暗適應1 h；③安放電極進行暗視F-ERG檢測并記錄實驗數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)：F-ERG按國際標準測量a波、b波潛時(T，ms)和振幅(A，μV)，波潛時值是從閃光刺激開始到反應波峰時間，a波振幅是從基線測量到a波波谷，b波振幅是從a波波谷到b波波峰。F-VEP的N1波、P1波潛時測量是從光刺激開始到反應波峰的時間，振幅測量是從前一個波峰(或谷)到相鄰的后一個波谷(或峰)。記錄時間點：鐵異物植入前1周及植入后1周、2周、1個月、3個月。

1.4 房水、玻璃體鐵離子濃度的檢測 在實驗結(jié)束時，抽取每只兔眼的房水、玻璃體，并設置空白對照組，檢測其中的鐵離子濃度并進行比較。同時觀察兔眼鐵異物的位置及其反應情況。

房水、玻璃體樣本采集：①全身麻醉，常規(guī)消毒，結(jié)膜囊滴入0.5%愛爾卡因滴眼液2次，開瞼器開瞼，鹽酸林可霉素滴眼液沖洗結(jié)膜囊；②手術(shù)顯微鏡下，用1.0 mL一次性注射器自角膜緣刺入前房，抽取房水0.1 mL，注入標記好的玻璃試管中封閉待查；③顯微玻璃體視網(wǎng)膜穿刺刀距角膜緣約1.5 mm處刺入玻璃體腔，20 G玻璃體切割頭自該切口進入，在切割玻璃體的同時用1.0 mL注射器連接抽吸管抽取玻璃體0.3 mL，注入標記好的玻璃試管中封閉待查。

房水、玻璃體鐵離子濃度測定委托溫州醫(yī)學院分析測試中心進行。檢測方法：①用天平賽多利斯(Sartorius CPA 224s max 220 g)給房水、玻璃體準確稱重后置于10 mL試管中，利用濕法消解，然后往試管中加入2 mL濃HNO3和1 mL 30%H2O2，放置過夜。利用自控電熱消化器程序升溫消解，最高消解溫度240 ℃，至近干時停止加熱，冷卻后用2%的HNO3介質(zhì)定容至10 mL，同時做空白試驗。②工作曲線制作：配置母液濃度為300 ng/mL，然后用體積分數(shù)2%的HNO3介質(zhì)系統(tǒng)自動稀釋配置50、100、150、200、300 ng/mL 5個標準濃度，做標準曲線；曲線的相關(guān)系數(shù)按新合理擬合，相關(guān)系數(shù)r= 1.000 0，Abs = 0.000 63×c，檢測房水、玻璃體鐵離子濃度。

2 結(jié)果

2.1 電生理檢查的比較 由于電生理檢查的波形及內(nèi)容較多，故選取有代表意義的暗視F-ERG混合反應a波、b波振幅及F-VEP N1波、P1波潛時作為檢查指標進行統(tǒng)計分析。因為隨著實驗時間的延長，電生理檢查結(jié)果可能會發(fā)生變化，所以對同一處理因素不同時間點的檢查結(jié)果分別進行比較(表中以時間因素表示)。同時比較了有銹、無銹鐵片眼及其對照眼的檢查結(jié)果(表中以處理因素表示)，而處理因素和時間因素之間的交互作用在表中以處理＊時間表示。

通過實驗發(fā)現(xiàn)，暗視F-ERG混合反應a波、b波振幅，無論每個時間點不同處理組之間的比較，還是5個時間點之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義。雖然隨著實驗時間的延長，有銹鐵片組和無銹鐵片組的F-VEP N1波、P1波潛時均存在延長的趨勢，但與其他時間點比較差異無統(tǒng)計學意義，且每個時間點不同處理組之間比較差異也無統(tǒng)計學意義，詳見表1～4。

表1 各處理組不同時間點暗視F-ERG混合反應a波振幅的比較(μV)

表2 各處理組不同時間點暗視F-ERG混合反應b波振幅的比較(μV)

表3 各處理組不同時間點F-VEP N1波潛時的比較(ms)

表4 各處理組不同時間點F-VEP P1波潛時的比較(ms)

2.2 鐵離子濃度的比較 房水鐵離子濃度各組差異有統(tǒng)計學意義，其中有銹鐵片組與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=3.32，P=0.004)。玻璃體鐵離子濃度各組差異有統(tǒng)計學意義，其中有銹鐵片組與空白對照組(t=2.84，P=0.01)、無銹鐵片組與空白對照組(t=3.23，P=0.005)比較差異有統(tǒng)計學意義，詳見表5。

表5 不同處理組房水、玻璃體鐵離子濃度(μg/g)的比較

2.3 鐵異物包裹組織情況 實驗結(jié)束時取出兔眼，檢查發(fā)現(xiàn)后極部鞏膜層間鐵異物被周圍組織包裹，未見明顯移位，包裹組織及其周圍未見明顯鐵銹沉著(附2頁圖3)。

3 討論

視覺電生理檢查是眼科臨床和科研上應用較為廣泛的一種客觀評價視功能的方法。通常認為，在人眼中，F(xiàn)-ERG暗視混合反應中的a波可反映視網(wǎng)膜光感受器功能，b波反映視網(wǎng)膜雙極細胞、Müller細胞等功能，故結(jié)合a、b波能很好反映視網(wǎng)膜的整體功能情況。在動物實驗中記錄F-ERG暗視混合反應，是評價視網(wǎng)膜功能很好的檢測指標。VEP除了反應視網(wǎng)膜中央?yún)^(qū)域的功能外，主要用于檢測視路的病變情況[1-2]。有學者[3-4]把電生理檢查引入兔眼的視功能檢測，給本實驗的設計提供了參考。而張作明等[5]為ERG和VEP記錄提供了標準化方案。

中碳鐵是在小型鑄造、模具生產(chǎn)等中小企業(yè)中應用最為廣泛的材料之一，其性質(zhì)活潑，在潮濕的環(huán)境中容易生銹。由于一些企業(yè)不太注重勞動防護，因而成為鐵異物損傷的主要來源。鐵異物損害最主要的表現(xiàn)是鐵質(zhì)沉著癥，由于氧化鐵與組織蛋白結(jié)合形成一種鐵蛋白化合物，容易沉積于角膜實質(zhì)和內(nèi)皮、虹膜基質(zhì)層、視網(wǎng)膜膠質(zhì)及房角等外胚葉來源的組織中，并產(chǎn)生銹染侵害[6-7]。為了明確有銹鐵是否比無銹鐵損害嚴重，本實驗設置了兩組。因為在球壁異物的定位方法中，B超可以顯示異物及眼球壁的兩者關(guān)系，能準確地判定球壁異物，但以CT對球壁異物的定位和診斷最為準確[8]。所以，本實驗選擇CT和B超作為鐵異物是否植入后極部鞏膜的評判方法。

Sieving等[9]在研究鐵質(zhì)沉著癥對眼外傷患者的損害時，發(fā)現(xiàn)ERG是檢測鐵質(zhì)沉著癥早期視網(wǎng)膜損害很有價值的臨床和實驗工具，為本實驗選擇ERG和VEP作為后極部鞏膜層間鐵異物對視網(wǎng)膜視神經(jīng)功能損害檢測指標提供了依據(jù)。因為兔眼無法識別圖形改變，故選取F-ERG和F-VEP作為電生理的檢測方法。由于兔眼較小，前后徑15～17 mm，平均16.3 mm[10]，所以本研究選擇在鼻側(cè)距離角膜緣8 mm處作板層鞏膜瓣植入鐵片，使其較接近且不損傷視神經(jīng)。

通過實驗發(fā)現(xiàn)兔眼ERG和VEP，無論每個時間點不同處理組之間的比較，還是5個時間點之間比較，差異均無統(tǒng)計學意義；但隨著實驗時間的延長，有銹鐵片組和無銹鐵片組的VEP N1波、P1波潛時均存在延長的趨勢。說明在3個月的實驗期內(nèi)，后極部鞏膜層間鐵片產(chǎn)生的氧化鐵彌散，可能改變了一小部分后極部視網(wǎng)膜的功能，但對視網(wǎng)膜視神經(jīng)的總體功能沒有產(chǎn)生明顯影響。在3個月實驗結(jié)束時，取出實驗眼，檢查發(fā)現(xiàn)鞏膜層間鐵片產(chǎn)生了明顯的組織包裹。這可能是其沒有產(chǎn)生移位的重要原因之一，同時組織包裹影響了氧化鐵向視網(wǎng)膜及其他眼內(nèi)組織的彌散，也從另一個側(cè)面驗證了電生理的檢查結(jié)果。但在分析實驗結(jié)束時，房水、玻璃體鐵離子濃度檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在鐵異物植入眼均高于空白對照眼，說明短期內(nèi)后極部鞏膜層間鐵異物對房水、玻璃體的鐵離子含量產(chǎn)生了較大影響。另外，實驗中還發(fā)現(xiàn)，由于取樣時異物對照眼的一只眼房水及另一只眼玻璃體樣本中滲入了少量血液，造成檢測到的鐵離子濃度分別為其均值的3倍左右，給結(jié)果分析產(chǎn)生了很大的影響，需剔除后才能得出正確的統(tǒng)計分析。所以，進行房水、玻璃體鐵離子濃度檢測實驗，采樣時一定要避免樣本中滲入血液。

Konstantinidis等[11]通過對2例球壁鐵異物患者隨訪觀察4～6年，發(fā)現(xiàn)鐵異物產(chǎn)生了明顯的纖維包裹，且患者視力維持在1.0的水平，隨訪ERG也相對穩(wěn)定。本研究在3個月實驗期內(nèi)，兔眼后極部鞏膜層間細小鐵異物，無論氧化與否均沒有對視網(wǎng)膜視神經(jīng)造成明確的電生理改變。雖然房水、玻璃體鐵離子濃度較鐵異物植入前有明顯升高，但何時產(chǎn)生鐵質(zhì)沉著癥尚需進一步觀察。提示臨床上遇到類似的鐵異物傷，假如異物較小且毗鄰視神經(jīng)，短期內(nèi)可以不必冒損傷視神經(jīng)的風險強行取出，但必須進行密切的隨訪觀察。由于兔眼的解剖結(jié)構(gòu)與人眼存在一定差異，本研究結(jié)果對眼科臨床的指導意義尚需在臨床工作中加以驗證。

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2010-12-09)

(本文編輯 諸靜英)

Impactofposteriorintrascleralironforeignbodyonrabbiteyes’physiologicalandbiochemicalfunctions

YOUYong-sheng，SHENLi-jun，QINHua，GAOChao＊，F(xiàn)ANWei,LIUYang，CHENYi-qi.DepartmentofOphthalmology,HospitalofOptometryandOphthalmology,WenzhouMedicalCollege，Wenzhou325027,China

Corresponding author：SHEN Li-jun,Email:slj@mail.eye.ac.cn

ObjectiveTo evaluate the effect of posterior intrascleral iron foreign body on rabbit eyes’ physiological and biochemical functions by electrophysiologic examination as well as ferri ion concentration measurement in aqueous humor and vitreous body.MethodsTwelve healthy adult Japan flap-eared white rabbits were randomly divided into two groups,the left eye was used as the experimental eye and the fellow eye as control.The medium carbon iron with the size of 2.0 mm×1.0 mm×0.2 mm was implanted into the posterior sclera of the rabbit’s left eye through the orbit.The first group was implanted with medium carbon iron without rust,and the second group with medium carbon iron with rust.Flash electroretinogram (F-ERG) and flash visual evoked potential (F-VEP) were examined for both eyes 1 week earlier before iron implantation and 1 week,2 weeks,1 month and 3 months after the implantation.Furthermore,the aqueous and vitreous ferri ion concentration in each eye was measured before sacrifice at the end of the experiment,and the blank control group was set simultaneously.SPSS 16.0 software package was used for statistic analysis by variance anova.ResultsThere were no statistical difference for the a-wave amplitude of F-ERG scotopic response compared each other at different time points (F=1.885，P=0.129) and different treatment groups (F=1.188，P=0.340).So did the ERG b-wave amplitude (Time FactorF=2.73，P=0.064；Treatment FactorF=1.114，P=0.367).There weren’t statistical difference for F-VEP N1-wave latent period (Time FactorF=1.605，P=0.263；Treatment FactorF=1.556，P=0.314) and P1-wave latent period (Time FactorF=2.329，P=0.092；Treatment FactorF=2.186，P=0.103).The aqueous ferri ion concentration was statistically significant among groups (F=3.791，P=0.022),and there was statistical difference between iron with rust group and blank control group(t=3.32，P=0.004).So did the vitreous ferri ion concentration (F=3.694，P=0.023).There was statistical difference between iron with rust group and blank control group(t=2.84，P=0.01) and between iron without rust group and blank control group(t=3.23，P=0.005).ConclusionsThere was no definite electrophysiological change of the rabbit eyes caused by the posterior intrascleral iron foreign body with or without rust in the experimental period of three months,but ferri ion concentration of aqueous and vitreous was obviously higher than that before iron foreign body implantation.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:77-81)

Intrascleral iron foreign body；Electrophysiological examination；Ferri ion concentration；Lagophthalmos

溫州市科學技術(shù)局計劃項目資助(Y20070082)

溫州醫(yī)學院附屬眼視光醫(yī)院眼科 溫州 325027

＊浙江省瑞安市康明眼科醫(yī)院眼科 瑞安 325200

沈麗君(Email:slj@mail.eye.ac.cn)