冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病大鼠樹突狀細(xì)胞功能的影響*

李洪濤, 張?zhí)焱小? 黃 靜, 劉 慧, 川上和羲

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510630；2日本東北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，日本 仙臺(tái) 980-8575)

冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病大鼠樹突狀細(xì)胞功能的影響*

李洪濤1, 張?zhí)焱?△, 黃 靜1, 劉 慧1, 川上和羲2

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 廣東 廣州 510630；2日本東北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，日本 仙臺(tái) 980-8575)

目的： 研究冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠樹突狀細(xì)胞(DCs)功能的影響及其分子機(jī)制。方法將大鼠隨機(jī)分為COPD模型組、冬蟲夏草治療組和正常對照組，觀察各組大鼠氣道病理改變，分離培養(yǎng)鼠DCs，ELISA法檢測DCs培養(yǎng)上清液和DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量。結(jié)果與正常對照組相比，COPD模型組和冬蟲夏草治療組的平均肺泡計(jì)數(shù)減少(Plt;0.05)，冬蟲夏草治療組高于COPD模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Pgt;0.05)。冬蟲夏草治療組DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)，IL-5水平各組無顯著差異(Pgt;0.05)。冬蟲夏草治療組DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)。結(jié)論冬蟲夏草可促使COPD大鼠DCs產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，機(jī)制可能與DCs產(chǎn)生的IL-12 p70促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ有關(guān)。

肺疾病，慢性阻塞性； 冬蟲夏草； 樹突狀細(xì)胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)本質(zhì)是慢性氣道非特異性炎癥性疾病，吸煙是COPD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。中醫(yī)認(rèn)為COPD屬“喘癥”范疇，肺腎兩虛是COPD的主要發(fā)病機(jī)制?！侗静輳男隆分杏浭觯骸跋x草性味甘平，入肺、腎二經(jīng)，保肺益腎，止血化痰，已勞嗽”。 長期臨床實(shí)踐證實(shí)冬蟲夏草(Cordycepssinensis)對緩解COPD癥狀，減少發(fā)作次數(shù)，改善生活質(zhì)量等方面有一定作用。但冬蟲夏草對COPD的作用機(jī)制尚有待闡明。新近我們研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草可通過樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[1]，但冬蟲夏草對COPD的免疫調(diào)節(jié)能否通過影響DCs尚不清楚。本研究采取大鼠被動(dòng)吸煙的方法建立COPD模型，通過冬蟲夏草喂養(yǎng)COPD大鼠，觀察冬蟲夏草對慢性阻塞性肺疾病模型DCs功能的影響，以探討冬蟲夏草防治COPD的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物模型制作及實(shí)驗(yàn)分組

參照管彩虹等[2]的方法稍加修改： SD大鼠18只，體重(202±25)g，鼠齡12周，隨機(jī)分組：COPD模型組、冬蟲夏草治療組、正常對照組，每組6只。(1)COPD模型組：在自制染毒箱中，每次被動(dòng)吸煙10支(廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司羊城牌香煙，焦油量13 mg/支，煙堿量1.2 mg/支)，每天2次，每次持續(xù)30 min，共8周。(2)冬蟲夏草治療組：在COPD模型制備的基礎(chǔ)上胃飼5 mL冬蟲夏草菌粉溶液(5 g/kg)(杭州眾生菌蕈生物技術(shù)有限公司)。(3)正常對照組：每天呼吸正?？諝狻OPD模型組和正常對照組每天胃飼5 mL的生理鹽水(NS)。各組動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。8周末從各組中隨機(jī)取1只大鼠，斷頸處死取右肺中葉進(jìn)行肺組織HE染色。肺組織切片在100倍光鏡下觀察，對每組5張切片連續(xù)計(jì)數(shù)3個(gè)視野內(nèi)和十字線相交的肺泡數(shù)，除以3后得平均肺泡計(jì)數(shù)。

2試劑

鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、鼠白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)購自PeproTech；IL-2購自深圳科興生物工程有限公司；FITC-CD83購自eBioscience；FITC標(biāo)記的鼠IgG同型對照抗體購自eBioscience；DCs完全培養(yǎng)基包括RPMI-1640(Gibco)，10%胎牛血清(杭州四季青公司)，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 mmol/L Hepes, 1×105U/L青霉素，1×105U/L鏈霉素；淋巴細(xì)胞分離液購自上海生化二廠；白細(xì)胞介素-5(interleukin-5, IL-5)、干擾素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)和白細(xì)胞介素-12 p70 (interleukin-12 p70, IL-12 p70)的ELISA試劑盒購自深圳達(dá)科為生物科技有限公司。

3DCs的分離、培養(yǎng)與鑒定

(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備：8周末從各組中取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，抽取肝素抗凝的右心房血8～10 mL，PBS緩沖液稀釋全血1倍并混勻。將混勻的全血輕輕置于淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，毛細(xì)吸管吸出中間的白膜層細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，獲得單個(gè)核細(xì)胞。(2)DCs體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)：DCs的分離和培養(yǎng)參照我們前期研究[3-4]。將獲得的單個(gè)核細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×109/L，加入6孔塑料培養(yǎng)板中(3 mL/well)，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)2 h，用37 ℃預(yù)溫的RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕洗出非黏附細(xì)胞。然后在貼壁細(xì)胞中用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF 和IL-4等細(xì)胞因子，隔天半量換液，繼續(xù)培養(yǎng)共8 d。相差倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化情況。調(diào)整成熟DCs濃度為2×108/L，加入Eppendorf管，每管25 μL，然后加入FITC-CD83單抗5 μL，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠IgG1作為同型對照，4 ℃冰箱中避光反應(yīng)30 min，預(yù)冷的PBS洗2遍，1%多聚甲醛固定后，流式細(xì)胞儀以488 nm激發(fā)光檢測，至少采集10 000個(gè)細(xì)胞，以CellQuest和WinMDI軟件分析，測定DCs的表型CD83。

4DCs培養(yǎng)上清液和DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量測定

取DCs培養(yǎng)第8 d上清液，分別按TNF-α、IL-12 p70酶聯(lián)免疫試劑盒說明書介紹的方法測定上清液中TNF-α、IL-12 p70的含量。收獲各組成熟DCs和IL-2 2×105U/L培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞(采用尼龍毛柱法分離大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞)。分別將5×105T細(xì)胞和5×104DCs加入6孔板共培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后收集培養(yǎng)上清液-70 ℃冰箱保存待測。應(yīng)用抗體夾心ELISA法檢測其IL-5和IFN-γ水平。取3復(fù)孔平均值。ELISA檢測按操作說明書進(jìn)行。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1肺組織切片和平均肺泡計(jì)數(shù)

COPD模型組肺組織具有COPD病理形態(tài)學(xué)改變：支氣管上皮細(xì)胞脫落，纖毛倒伏、黏連，杯狀細(xì)胞增生，部分肺泡壁破壞、融合，細(xì)支氣管壁及周圍組織有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤。冬蟲夏草治療組上述病理改變較模型組減輕。正常對照組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)正常，病理改變見圖1。與正常對照組(62±8)相比，COPD模型組(38±16)、冬蟲夏草治療組(48±9)的平均肺泡計(jì)數(shù)減少(n=5，Plt;0.05)，冬蟲夏草治療組高于COPD模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n= 5，Pgt;0.05)。

Figure 1. Histology of lung tissues from the three groups (HE staining,×100). A:control;B:COPD;C:Cordyceps sinensis.

2各組DCs分泌細(xì)胞因子的變化

ELISA檢測各組DCs培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量結(jié)果見表1：冬蟲夏草治療組DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型組和正常對照組，差異顯著(Plt;0.05)。

3各組DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的變化

DCs的相差顯微鏡示有毛刺狀突起，流式細(xì)胞儀表型檢測示CD83陽性，符合我們以往研究[3-4]。各組DCs與同種自體T細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量見表2：冬蟲夏草治療組DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型組和正常對照組，差異顯著(Plt;0.05)；而IL-5水平各組無顯著差異(Pgt;0.05)。

表1 各組DCs細(xì)胞上清液細(xì)胞因子變化

討 論

鑒于吸煙是發(fā)生COPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本實(shí)驗(yàn)采用給大鼠反復(fù)被動(dòng)吸煙的方法建立COPD模型符合人類COPD發(fā)生發(fā)展的自然過程，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的肺組織形態(tài)(見圖1)符合慢性支氣管炎阻塞性肺氣腫特征，可用于COPD的實(shí)驗(yàn)研究。平均肺泡計(jì)數(shù)是衡量肺泡密度的標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草治療組平均肺泡計(jì)數(shù)雖然低于對照組，但比COPD模型組平均肺泡計(jì)數(shù)增加，說明冬蟲夏草雖然不能阻止COPD的形成，但在一定程度上能有效抑制其肺泡的破壞，這對COPD的防治有積極作用。冬蟲夏草屬肉座菌目麥角菌科蟲草屬植物，為蟲草菌的子座與其寄生蝙蝠蛾幼蟲尸體的復(fù)合物。冬蟲夏草始載于清，其具有補(bǔ)肺益腎、止咳化痰之效，用于久咳虛喘、勞嗽痰血等。冬蟲夏草具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗炎、抗氧化及舒張支氣管平滑肌等作用[5-6]。

表2 各組DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液細(xì)胞因子變化

冬蟲夏草可通過激活巨噬細(xì)胞和DCs以調(diào)節(jié)各類免疫反應(yīng)，并抑制LPS誘導(dǎo)的DCs激活[7-8]。Li等研究發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草在無炎癥環(huán)境下，可促使DCs趨向于Th1型免疫反應(yīng)，在炎癥環(huán)境下，則由Th1型免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)向?yàn)門h2型免疫反應(yīng)[8]，表明冬蟲夏草可通過DCs調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡。2010年我們的一項(xiàng)前期研究中，通過基因敲除鼠及熒光報(bào)告分析發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草能激活鼠骨髓來源的DCs釋放IL-12 p40、TNF-α并表達(dá)CD40而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而進(jìn)一步說明了冬蟲夏草通過DCs調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡的具體分子機(jī)制[1]。

然而，冬蟲夏草對COPD的免疫調(diào)節(jié)能否通過影響DCs尚有待研究。本研究表明冬蟲夏草治療組DCs-T細(xì)胞共培養(yǎng)后上清液中IFN-γ水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)，且冬蟲夏草治療組DCs上清液中TNF-α和IL-12 p70水平高于COPD模型組和正常對照組(Plt;0.05)，表明冬蟲夏草可促使COPD模型DCs產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，其機(jī)制可能與冬蟲夏草干預(yù)后，COPD模型DCs產(chǎn)生IL-12，IL-12促使T細(xì)胞產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子IFN-γ有關(guān)。而且，DCs分泌的促炎性細(xì)胞因子TNF-α也參與到免疫反應(yīng)中。本研究提示冬蟲夏草對COPD大鼠模型有抑制作用，與冬蟲夏草促使DCs產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡有關(guān)，從而為臨床防治提供了一定的理論依據(jù)。

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在小鼠全身炎癥反應(yīng)中PGC-1α促進(jìn)急性腎損傷恢復(fù)的作用

敗血癥相關(guān)急性腎損傷(AKI)是一種常見的疾病狀態(tài)，與典型缺血性腎損傷的區(qū)別是腎小管細(xì)胞死亡的病變較輕。美國科學(xué)家最近在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素血癥能減少氧氣運(yùn)輸?shù)侥I，但并不明顯改變腎組織中的氧含量，提示腎細(xì)胞的耗氧量降低，并有腎小管線粒體腫脹和功能受損?；虮磉_(dá)譜顯示敗血癥相關(guān)急性腎損傷時(shí)，與氧化磷酸化有關(guān)的基因被選擇性地抑制，當(dāng)腎小球功能恢復(fù)正常時(shí)這些基因可再度被激活。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)輔激活蛋白-1α(PGC-1α)是線粒體生物轉(zhuǎn)化和新陳代謝的主要調(diào)節(jié)物，其活性與上述模式相符，而且受抑制程度也和AKI的程度而相對應(yīng)。此外，在腫瘤壞死因子 γ(TNF-γ)的作用下，腎小管細(xì)胞下調(diào)PGC-1α的表達(dá)，降低耗氧量。然而，過量的PGC-1α與后者的作用相反。腎小球或腎小管部位特異性PGC-1α基因敲除的小鼠都能維持正常的基礎(chǔ)腎功能，但內(nèi)毒素血癥能使這些小鼠的腎功能持續(xù)受損。以上結(jié)果提示，誘導(dǎo)PGC-1α的生成可能對恢復(fù)敗血癥相關(guān)急性腎損傷的腎功能有利。

J Clin Invest, 2011,121(10): 4003-4014(唐清亮)

InfluenceofCordycepssinensisoncytokineprofileofdendriticcellsinchronicobstructivepulmonaryratmodel

LI Hong-tao1, ZHANG Tian-tuo1, HUANG Jing1, LIU Hui1, KAWAKAMI Kazuyoshi2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,ThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;2SchoolofMedicine,TohokuUniversity,Sendai980-8575,Japan.E-mail:zhtituli@163.com)

AIM: To investigate the effect ofCordycepssinensis(CS) on dendritic cells (DCs) in the rat model of chronic obstructive pulmonary disease (COPD).METHODSEighteen Sprague-Dawley male rats were randomly divided into 3 groups: control group, COPD group and CS group.The rats in the latter 2 groups were exposed to cigarette smoking for 8 weeks with (CS group) or without (COPD group) CS treatment. The rats in control group were maintained under normal condition. After 8 weeks,the histological changes of the right lung were observed under microscope. The DCs from the 3 groups were harvested and the supernatants of DCs were analyzed for the levels of TNF-α and IL-12 p70 by commercially available ELISA kit. The DCs were then washed and coculturedinvitrowith autologous T cells purified by a nylon cotton column. The supernatants of DCs-T coculture were collected after 72 h incubation, and analyzed for the levels of interleukin-5 (IL-5) and interferon-γ (IFN-γ) by ELISA.RESULTSAnalysis of the rat lung parenchyma revealed a significant decrease in the mean alveolar number, an indicator of alveolar density, in COPD group (38±16) and CS group (48±9) in comparison with control group (62±8). The mean alveolar number tended to be increased in CS group than that in COPD group, although this difference did not achieve statistical significance (Pgt;0.05). The concentrations of TNF-α and IL-12 p70 in the culture supernatants of DCs and IFN-γ in the supernatants of DCs-T cocluture were up-regulated in CS group as compared with those in COPD group and control group (Plt;0.05). The level of IL-5 in the DCs-T coculture supernatants of the 3 groups did not show differences with statistical significance (Pgt;0.05).CONCLUSIONThe therapeutic effects of CS on COPD rats may be related to modulation of Th1 and Th2 cell functions. This effect is probably mediated through IL-12 p70 produced by DCs and Th1 cytokine IFN-γ produced by autologous T cells.

Pulmonary disease,chronic obstructive; Cordyceps sinensis; Dendritic cells

1000-4718(2011)12-2372-04

R563.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.025

2011-07-27

2011-10-17

廣東省中醫(yī)藥局基金資助項(xiàng)目(No. 2009156)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. A2009194)

△通訊作者 Tel: 020-85252241; E-mail: zhtituli@163.com