袁偉鋒， 李 理， 徐 虹， 黃文杰△

(1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內科， 廣東 廣州 510010；2南方醫(yī)科大學研究生學院， 廣東 廣州 510515)

·短篇論著·

TNFR-Fc減輕LPS所致小鼠ALI炎癥反應損傷*

袁偉鋒1,2， 李 理1， 徐 虹1,2， 黃文杰1△

(1廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院呼吸內科， 廣東 廣州 510010；2南方醫(yī)科大學研究生學院， 廣東 廣州 510515)

目的： 評價腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)能否有效下調炎癥反應而減輕急性肺損傷(ALI)小鼠的肺組織破壞。方法小鼠隨機分為脂多糖(LPS)組、TNFR-Fc+LPS組和對照組。氣管內滴入LPS復制ALI小鼠模型，TNFR-Fc組在滴入LPS前24 h腹膜腔注射TNFR-Fc (0.4 mg/kg)，在滴入LPS后2 h收集標本，檢測肺濕/干重、肺泡蛋白含量與肺組織病理評分；ELISA法檢測血清TNF-α濃度及檢測肺泡灌洗液與血清IL-1β、IL-6、IL-10與IFN-γ濃度。結果TNFR-Fc顯著降低血清TNF-α濃度(Plt;0.05)，輕度降低肺濕/干重比例，顯著降低BALF蛋白濃度(Plt;0.05)，顯著降低ALI評分數(shù)值(Plt;0.05)。TNFR-Fc顯著降低致炎癥細胞因子IL-6在BALF(Plt;0.05)與血清(Plt;0.05)中的濃度，輕度提高BALF中IL-10濃度(Pgt;0.05)，但其差異不顯著，亦能顯著提高血清IL-10濃度(Plt;0.05)。IL-1β與IFN-γ水平處理前后變化不顯著。結論TNFR-Fc中和ALI中過度表達的TNF-α，下調以IL-6為代表的炎癥反應，減輕ALI的肺組織破壞。

腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白； 急性肺損傷； 炎癥

細菌感染后誘發(fā)的炎癥反應失衡是引起急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的重要因素。炎癥反應失控放大、加重了ALI病情，甚至發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征與多器官功能衰竭。因此，ALI的治療不僅需要有效的抗感染療法，而且需要對機體防御系統(tǒng)進行調控，減少炎癥反應對肺組織結構細胞的破壞，維持呼吸系統(tǒng)功能。在炎癥反應始動與放大的過程中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)起著重要作用。TNF-α是啟動和介導炎癥反應放大的主要炎癥介質。肺泡巨噬細胞在LPS刺激后初次表達TNF-α，初次釋放的TNF-α與其它炎癥細胞的TNF受體(TNF receptor, TNFR)結合，活化炎癥反應信號，正反饋放大炎癥反應[1]。中和TNF-α或可抑制炎癥反應的放大過程，減輕ALI的炎癥損傷。本研究復制LPS致ALI小鼠模型，以TNFR-Fc中和循環(huán)過量的TNF-α，通過肺濕/干重比例、肺泡腔蛋白滲出、肺組織病理、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)與血清中多個炎癥細胞因子濃度等方面評價TNF-α中和對ALI的肺組織保護作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 SPF級8周齡雌性BALB/c小鼠共30只，平均體重20 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。所有操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。小鼠在實驗前自由進食和進水。

1.2主要試劑與設備 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coliO55∶B5, Sigma)；注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體-Fc融合蛋白(上海中信國健藥業(yè)有限公司，批號為20090501)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天公司)，小鼠白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、IL-10、TNF-α與干擾素γ(interferon γ,IFN-γ) ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，電熱烘干箱，酶標儀，光學顯微鏡(奧林巴斯，BX51)。

2方法

2.1實驗設計 30只小鼠隨機平均分為LPS組、TNFR-Fc+LPS組與對照組。LPS組小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，鈍性分離氣管，氣管內滴入LPS(5 mg/kg)。TNFR-Fc+LPS組小鼠腹腔注射TNFR-Fc(0.4 mg/kg)，24 h后如上法進行LPS氣管內滴入。對照組小鼠氣管內滴入與LPS溶液等體積的生理鹽水。分別于LPS/生理鹽水滴入后0 h與2 h處死小鼠獲取檢測樣本。

2.2肺組織濕/干重比例測量 小鼠水合氯醛麻醉后經(jīng)腹主動脈充分放血，開胸后取肺，濾紙吸干肺表面液體，置電子天平稱量肺組織濕重。稱量濕重后肺置于電熱烘干箱80 ℃干燥48 h后取出，稱量肺組織干重并計算濕/干重比例。

2.3BALF蛋白含量檢測 小鼠水合氯醛麻醉后經(jīng)腹主動脈充分放血，剪開頸前皮膚，分離暴露氣管，向心端插入套管針，4 ℃ PBS灌洗3次，共2 mL，計算總回收率，納入回收率達80%樣本，5 000 r/min離心10 min，留取上清液，BCA法檢測蛋白含量(操作按試劑盒操作說明進行)。

2.4細胞因子濃度檢測 同上法收集BALF上清液，ELISA法檢測血清TNF-α濃度，以及BALF與血清IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ濃度(操作按ELISA試劑盒說明書進行)。

2.5肺組織病理半定量評分 小鼠經(jīng)腹主動脈充分放血后分離肺組織，置10%中性甲醛中固定。肺組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片后行HE染色，參照Mikawa等[2]的方法以4項指標進行肺損傷評分：(1)肺泡充血；(2)出血；(3)間隙或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集；(4)肺泡間隔增厚或透明膜形成。0分：極輕度損傷；1分：輕度損傷；2分：中度損傷；3分：重度損傷；4分：嚴重損傷。將4項指標得分相加作為總分。由3名病理科醫(yī)師分別對肺組織損傷程度進行評分，取3者平均值。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1肺濕/干重比例

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺濕/干重比例在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均無顯著差異(4.810±0.866vs3.480±0.193；4.700±0.359vs3.700±0.315，Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組與LPS組小鼠肺濕/干重比例無顯著差異(4.700±0.359vs4.810±0.866，Pgt;0.05)，見表1。

表1 TNFR-Fc對LPS致ALI小鼠肺濕/干重比例、BALF蛋白含量與肺損傷評分的影響

2肺泡灌洗液蛋白含量

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF蛋白含量在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著性增高(793.430±87.168vs69.130±19.807，Plt;0.05；519.460±88.579vs77.440±8.533，Plt;0.05)。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組BALF蛋白含量顯著低于LPS組(519.460±88.579vs793.430±87.168，Plt;0.05)，見表1。

3肺組織病理評分

在滴入生理鹽水后2 h，對照組小鼠肺泡仍結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見水腫液；LPS組小鼠在氣管內滴入LPS后2 h肺組織肺泡間隔增厚并破壞，炎細胞浸潤，無法辨認清晰肺泡結構；TNFR-Fc+LPS組小鼠在氣管內滴入LPS后2h肺組織損傷較輕，肺泡間隔增厚，但間隔破壞不明顯，可辨認肺泡結構，炎癥細胞浸潤，主要見于間隔及間隔內血管，部分肺泡腔內有少量滲出。LPS/生理鹽水滴入后2 h 3組小鼠肺組織病理見圖1。LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織病理評分在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著升高(LPS組1.600±0.683vs10.000±0.365，Plt;0.05；TNFR-Fc+LPS組1.530±0.650vs6.800±0.901，Plt;0.05)。LPS滴入后2 h，TNFR-Fc+LPS組評分顯著低于LPS組(6.800±0.901vs10.000±0.365，Plt;0.05),見表1。

Figure 1. Lung histology from three group animals (×200).A:control;B:LPS;C:TNFR-Fc+LPS.

4TNFR-Fc中和TNF-α效果檢測

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清TNF-α濃度在LPS滴入后2 h與0 h相比均顯著增高[(33.770±13.295)ng/Lvs(634.900±89.082)ng/L，Plt;0.05；(39.530±20.044)ng/Lvs(119.400±50.874)ng/L，Plt;0.05]。在氣管內滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清TNF-α濃度顯著低于LPS組[(119.400±50.874)ng/Lvs(634.900±89.082)ng/L，Plt;0.05],見表2。

表2 TNFR-Fc對LPS致ALI小鼠血清/BALF細胞因子濃度的影響

5TNFR-Fc對BALF與血清IL-1β濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF的IL-1β濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比無顯著差異(Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組BALF的IL-1β濃度無顯著差異[(391.670±32.653)ng/Lvs(352.580±66.868) ng/L，Pgt;0.05]。

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-1β濃度在LPS滴入后2 h與0 h相比無顯著差異(Pgt;0.05)。在氣管內滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-1β濃度無顯著差異[(66.730±16.716)ng/Lvs(58.590±4.508) ng/L，Pgt;0.05]，見表2。

6TNFR-Fc對BALF與血清IL-6濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-6濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著上升[(61.730±15.422)ng/Lvs(1 440.150±184.585)ng/L，Plt;0.05；(60.190±14.273)ng/Lvs(468.370±123.615)ng/L，Plt;0.05]。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-6濃度顯著低于LPS組[(468.370±123.615)ng/Lvs(1 440.150±184.585)ng/L,Plt;0.05]。

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-6濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比顯著升高[(20.290±2.246)ng/Lvs(1 739.030±423.206)ng/L，Plt;0.05]；(19.370±2.183)ng/Lvs(1 073.480±156.062)ng/L，Plt;0.05]。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-6濃度顯著低于LPS組[(1 073.480±156.062)ng/Lvs(1 739.030±423.206) ng/L，Plt;0.05],見表2。

7TNFR-Fc對BALF與血清IL-10濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-10濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均無顯著差異(Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IL-10濃度無顯著差異[(264.460±51.147)ng/Lvs(348.520±76.894)ng/L；Pgt;0.05]。

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-10濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均顯著升高[(211.310±10.753) ng/Lvs(958.130±125.345) ng/L，Plt;0.05；(209.480±10.466) ng/Lvs(1 522.520±86.189) ng/L，Plt;0.05]。在滴入LPS后2 h，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-10濃度顯著高于LPS組[(1 522.520±86.189) ng/Lvs(958.130±125.345) ng/L，Plt;0.05],見表2。

8TNFR-Fc對BALF與血清IFN-γ濃度的影響

LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IFN-γ濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比均無顯著改變(Pgt;0.05)。在滴入LPS后2 h，LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF中IFN-γ濃度無顯著差異[(93.680±8.792)ng/Lvs(90.810±13.654)ng/L；Pgt;0.05]。

LPS組小鼠血清IFN-γ濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比無顯著差異[(86.040±6.779)ng/Lvs(107.970±11.920)ng/L，Pgt;0.05]。TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IFN-γ濃度在氣管內滴入LPS后2 h與0 h相比顯著升高[(88.130±7.177)ng/Lvs(119.150±16.533)ng/L，Plt;0.05]。在LPS處理后2 h，LPS組小鼠血清IFN-γ濃度與TNFR-Fc+LPS組相比無顯著差異[(107.970±11.920)ng/Lvs(119.150±16.533)ng/L，Pgt;0.05],見表2。

討 論

多種感染因素均可引起ALI，但近年來認為ALI的直接原因并不是病原微生物對組織細胞的直接破壞，而是機體對病原微生物產(chǎn)生不適當?shù)拿庖邞?，尤其是過度的炎癥反應。因此，針對ALI的病理生理過程，進行適當?shù)拿庖哒{控或有助于減輕過度炎癥反應對肺組織損傷。

TNF-α是炎癥反應激活后迅速釋放的快反應炎癥介質。當細胞接受炎癥信號，TNF-α迅速表達及釋放，初次釋放的TNF-α可與其它炎癥細胞的TNFR結合，啟動機體的免疫應激，正反饋放大炎癥反應[1]。眾多基礎研究支持血清或肺泡灌洗液中TNF-α濃度與ALI嚴重程度正相關[3]。中和過高濃度的游離TNF-α，控制炎癥損傷從而降低ALI危害是目前爭議較多的一種治療策略[4,5]。在本研究中，以氣管內滴入LPS復制ALI小鼠模型，采用代表性的TNFR-Fc中和游離TNF-α，評價中和TNF-α對ALI的炎癥反應調節(jié)作用與肺保護效應。

TNFR-Fc是TNFR的膜外區(qū)與IgG的Fc段形成的融合蛋白，能有效降低外周血游離TNF-α濃度，已普遍應用于因TNF-α分泌異常引起的免疫性疾病，如類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎、Crohn病等[6,7]。在本研究中，提前24 h進行TNFR-Fc腹腔內注射能有效地降低ALI小鼠血清TNF-α濃度，但仍高于對照組，說明上述TNFR-Fc預處理未完全清除循環(huán)中的TNF-α，避免了“零濃度”TNF-α導致的免疫功能缺失。同時，氣管內滴入LPS導致明顯的肺組織結構破壞，肺組織大片壞死，大量血管床破壞，而在中和TNF-α后，肺組織病理性破壞顯著減輕，ALI評分下降，客觀地呈現(xiàn)中和TNF-α對肺組織的保護作用。肺泡蛋白滲出是血管通透性增加的結果，其變化規(guī)律與病理損傷一致。LPS氣管內滴入顯著增高BALF中蛋白濃度，證實ALI時有明顯的血管損傷；中和TNF-α則明顯減輕炎癥反應引起的血管破壞，蛋白滲出減少。但ALI時肺水腫程度與肺病理損傷變化不同步。氣管內滴入LPS后肺濕/干重比例僅稍有升高，中和TNF-α后肺濕/干重比例僅輕度降低。我們考慮氣管內滴入LPS誘導的肺內性ALI以肺組織結構破壞為主，肺組織大片壞死，大量血管床破壞，此部分缺乏血管反應，炎癥滲出程度較低，因此整體的肺水腫程度增高并不明顯。而給予TNFR-Fc預處理只能對非壞死區(qū)域的肺組織起作用，部分減輕間質水腫。壞死區(qū)域“平均化”了LPS引起的肺間質水腫，無法清晰地顯示出中和TNF-α而減輕肺水腫的作用。

IL-6是一個在ALI的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用的促炎細胞因子，促進了ALI的組織破壞[8]。IL-6能誘導急性期反應蛋白的合成，其血清水平可作為判斷嚴重感染預后的指標[9]。在本研究中，小鼠在氣管滴入LPS后BALF與血清IL-6水平均迅速升高，而TNFR-Fc預處理能有效地降低IL-6濃度，提示中和TNF-α有利于下調炎癥反應。IL-1β與IFN-γ是另外兩個上調炎癥反應的細胞因子。在本研究中，氣管內滴入LPS均未明顯增高BALF及血清IL-1β、IFN-γ濃度，而且TNFR-Fc預處理也未能影響B(tài)ALF及血清IL-1β、IFN-γ濃度，提示TNFR-Fc對炎癥反應的干預并不通過IL-1β或IFN-γ起作用。

IL-10是有顯著炎癥反應抑制作用的細胞因子。在炎癥反應激活時IL-10也隨之表達。炎癥反應激活及免疫細胞的活化有利于病原微生物的清除，但可能損傷機體正常細胞[10]。IL-10能控制炎癥過度放大，避免炎癥反應損傷機體正常組織細胞。在本研究中，LPS激活炎癥反應伴隨血清IL-10濃度升高，TNFR-Fc預處理使其濃度更高，提示中和TNF-α能有效減低ALI的炎癥反應程度。此外，我們發(fā)現(xiàn)無論在BALF中或血清中，LPS均可顯著地升高IL-6與IL-10的比值(本文未顯示此數(shù)據(jù))。以IL-6為代表的促炎因子與以IL-10為代表的抑炎因子比值反映了ALI存在炎癥反應失衡——促炎反應過度活化與抑炎作用相對不足。而TNFR-Fc預處理則顯著地降低BALF及血清中IL-6/IL-10比值(本文未顯示此數(shù)據(jù))，提示中和TNF-α、減輕ALI結構細胞損傷與恢復促炎反應與抑炎癥反應的平衡密切相關。

綜上所述，由LPS誘發(fā)的ALI中存在過度放大的炎癥反應而導致結構細胞的損傷。TNFR-Fc通過中和過量的TNF-α，下調由TNF-α介導的炎癥反應放大過程，重建以IL-6與IL-10為代表的促炎/抑炎平衡，從而減輕LPS引起的全身與肺局部炎癥反應，有效地減輕肺泡滲出與肺組織結構破壞，提示對ALI的病理生理過程進行適當?shù)拿庖吒深A有可能成為治療ALI的新策略。

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ProtectiveroleofTNFR-Fcinmouseacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide

YUAN Wei-feng1,2, LI li1, XU Hong1,2, HUANG Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China;2PostgraduateInstituteofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:huangyelu1029@vip.163.com)

AIM: Acute lung injury (ALI) is associated with excessive inflammation caused by high tumor necrosis factor α(TNF-α) concentration. We hypothesized that anti-TNF-α therapy would have beneficial effects on mouse ALI model via down-regulating the inflammation.METHODSLipopolysaccharide(LPS,5 mg/kg) was intratracheally administered to BALB/c mice (8～10 weeks old). Twenty-four hours before LPS treatment, the mice were intraperitoneally injected with TNF receptor-Fc fusion protein(TNFR-Fc) once at a dose of 0.4 mg/kg. Wet to dry ratio of the lung tissues and protein concentration in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were detected. The histological changes of the lung tissues were also observed to evaluate lung injury. The concentration of TNF-α in serum as well as interleukin-1β(IL-1β), IL-6, IL-10 and interferon γ(IFN-γ) in BALF and serum were measured by ELISA.RESULTSTNFR-Fc treatment significantly decreased the concentration of serum TNF-α (Plt;0.05), the score of the lung histology and protein concentration in BALF (Plt;0.05). However, the wet to dry ratio of the lung was not obviously changed. The level of IL-6 was decreased both in BALF (Plt;0.05) and in serum (Plt;0.05) after TNFR-Fc treatment. The concentration of IL-10 increased significantly in serum (Plt;0.05) but not in BALF (Pgt;0.05). The concentrations of IL-1β and IFN-γ in BALF and serum were not obviously affected by TNFR-Fc treatment.CONCLUSIONTreatment with TNFR-Fc significantly attenuates LPS-induced ALI via affecting the expression of IL-6 and IL-10.

Tumor necrosis factor receptor-Fc fusion protein; Acute lung injury; Inflammation

1000-4718(2011)12-2387-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.028

2011-04-18

2011-10-09

國家自然科學基金資助項目(No. 81070003)

Tel: 020-36653555; E-mail: huangyelu1029@vip.163.com