郭 軍， 蔡 軍， 李自成△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510630；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟中心，北京 100020)

原發(fā)性高血壓患者ABCG4基因啟動子的甲基化差異分析*

郭 軍1， 蔡 軍2， 李自成1△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510630；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟中心，北京 100020)

目的分析原發(fā)性高血壓患者DNA啟動子甲基化的差異，期待從表觀遺傳學(xué)的角度初步揭示人類原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制。方法實驗對象分為正常對照組和原發(fā)性高血壓組，提取外周血單個核細胞全基因組DNA。通過DNA甲基化芯片高通量篩選，共得到差異甲基化基因627個。篩選FZD7、LRP、TTBK1、USFP1、SYCE1、NDUSF8、ZNF540和ABCG4共8個可能與高血壓相關(guān)基因，并進行后續(xù)亞硫酸氫鹽測序PCR分析。結(jié)果8個候選基因中，ABCG4差異甲基化程度最為顯著。原發(fā)性高血壓組ABCG4基因啟動子區(qū)甲基化率為18.3%，正常組為32.4%,兩者差異顯著(Plt;0.01)。結(jié)論本研究證實原發(fā)性高血壓患者ABCG4基因啟動子低甲基化，可能在原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制中起到一定的作用。

甲基化； 高血壓； 啟動子; 基因，ABCG4

近年來通過對疾病的表觀遺傳學(xué)機制研究包括染色質(zhì)重塑、DNA甲基化及組蛋白修飾、X染色體失活、非編碼RNA調(diào)控等，已經(jīng)讓我們了解了表觀遺傳機制、基因表達和環(huán)境之間的關(guān)系，并期望能糾正或降低那些能夠?qū)е录膊〉谋碛^基因的不穩(wěn)定性，指導(dǎo)疾病的診治和新藥的研制[1]。高血壓是心腦血管疾病發(fā)生的主要風(fēng)險因素，而近90%的原發(fā)性高血壓病因不明。近年來，研究者們試圖從遺傳學(xué)改變?nèi)鐔魏塑账岫鄳B(tài)性的角度尋找原發(fā)性高血壓的病因[2]，雖然已經(jīng)有所發(fā)現(xiàn)，但是這些因素均未能揭示大部分的原發(fā)性高血壓患者的發(fā)病原因。 因此，本實驗通過結(jié)合甲基化芯片篩選及亞硫酸氫鹽測序PCR的方法分析原發(fā)性高血壓患者DNA啟動子甲基化的差異，期待從DNA甲基化的角度初步揭示人類原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制。

材 料 和 方 法

1研究對象

本實驗分正常對照組和原發(fā)性高血壓組，其中正常組4例，原發(fā)性高血壓組6例，抽取外周靜脈血，采用淋巴細胞分離液離心分離提取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。納入對象排除繼發(fā)性高血壓、其它心臟疾病、腦血管疾病、糖尿病以及其它合并癥。基本資料見表1。該實驗通過醫(yī)院倫理委員會批準。

2全基因組DNA抽提

抽取患者清晨空腹狀態(tài)下靜脈血，置于EDTA血常規(guī)管，收集單個核細胞，采用DNA提取試劑盒(DNeasy Blood amp; Tissue Kit,QIAGEN)抽提全基因組DNA，并儲存于-80 ℃至下一步實驗。

表1 研究對象的基本資料

3DNA甲基化芯片高通量篩選

用美國 EZ DNA Methylation Kit 將DNA 中未甲基化CG 島的C 轉(zhuǎn)化為T?；蚪M DNA 經(jīng)NaOH 變性后，加入含引物的MA2(Multi Sample Amplification 2 Mix)和含酶的MSM(Multi Sample Amplification Master Mix)，于37℃孵育20-24 h完成擴增。擴增好的 DNA 中加入FMS(Fragmentation Solution)，37 ℃酶切1 h。加入含鹽份溶液PM1 和異丙醇，使片段化的DNA 沉淀。加入含對照 DNA 的RA1 于48 ℃放置1 h，使其充分懸浮。懸浮的DNA 變性后加到芯片上，48 ℃雜交箱中雜交16-24 h。將芯片分別浸泡在WB1 和PB1 溶液中1 min，將未雜交的和非特異雜交的DNA 洗去為染色做好準備，組裝好雜交艙。以雜交在芯片上的DNA 為模板，加入TEM(含SBE 酶、biotin-dNTP和DNP)使芯片微珠上的寡核苷酸鏈完成單堿基延伸；加入95%甲酰胺/1 mmol/L EDTA，去除目標DNA，芯片上僅留微珠上的單鏈探針。加入LTM和ATM，完成染色過程。將芯片浸泡在PB1中洗滌后浸泡在XC4 溶液中保護，最后將芯片放在真空干燥器內(nèi)干燥，等待掃描。掃描儀通過雙色激光激發(fā)微珠上的熒光基團，掃描得到雜交信號，軟件自動分析給出代表甲基化程度值。

4亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfitesequencingPCR，BSP)

全基因組DNA樣品各取約500ng，用MethylCode Bisulfite Conversion Kit(Invitrogen)對基因組DNA進行甲基化處理，并純化、回收。用合成好的引物和處理過的基因組DNA進行PCR擴增。引物序列詳見表2。切膠回收PCR產(chǎn)物。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa)連接，室溫連接2 h。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂皿(Amp+)，37 ℃培養(yǎng)過夜。每個平板挑10個克隆進行菌落PCR鑒定；將菌落PCR呈陽性的克隆接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Axygen)提取質(zhì)粒。質(zhì)粒測序，測序結(jié)果采用BiQ Analyzer甲基化分析專用軟件比對。

表2 亞硫酸氫鹽測序PCR采用的引物序列信息

5統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1DNA甲基化芯片高通量篩選結(jié)果

本實驗將正常組與疾病組芯片上全基因組甲基化探針的數(shù)據(jù)進行比較，利用t檢驗計算探針的顯著水平，共得到差異甲基化基因627個，其中甲基化程度升高的基因位點有132個，甲基化程度低的基因位點有495個。原發(fā)性高血壓全基因組的DNA甲基化芯片高通量篩選結(jié)果見圖1。

Figure 1. DNA methylation chip results of chromosomes(Chr) in human primary hypertension. Dense green sites indicate hypermethylation.

2亞硫酸氫鈉測序PCR

在差異甲基化基因中選取FZD7、LRP、TTBK1、USFP1、SYCE1、NDUSF8、ZNF540和ABCG4共8個可能與高血壓相關(guān)的基因，并進行后續(xù)BSP分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個候選基因中，ABCG4差異甲基化程度最為顯著。原發(fā)性高血壓組ABCG4基因啟動子區(qū)甲基化呈相對低甲基化，啟動子區(qū)甲基化率為18.3%(n=6)，正常組基因啟動子區(qū)甲基化率為32.4%(n=4)；原發(fā)性高血壓組ABCG4基因啟動子區(qū)甲基化率比正常組基因啟動子區(qū)甲基化率低14.1%(Plt;0.01)，見表3、圖2。

表3 原發(fā)性高血壓組與正常組基因甲基化程度

Figure 2. The methylation status of ABCG4 gene promoter. Open and closed circles indicate unmethylated and methylated CpGs,respectively. Fork site is undetermined. A: ABCG4 gene promoter methylation status in primary hypertension group；B: ABCG4 gene promoter methylation status in control group.

討 論

原發(fā)性高血壓的發(fā)生機制非常復(fù)雜，研究者們試圖從遺傳學(xué)改變?nèi)鐔魏塑账岫鄳B(tài)性的角度尋找原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制，雖然已經(jīng)有所發(fā)現(xiàn)，但是僅能解釋少數(shù)高血壓的發(fā)病機制，而不能揭示大部分的原發(fā)性高血壓患者的發(fā)病機制。

近年來，一系列的研究報道揭開了高血壓表觀遺傳學(xué)機制的冰山一角。2007年Bogdarina等[3]發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠的血管緊張素II受體AT1b的基因及蛋白表達均顯著上調(diào)，AT1b基因近端的啟動子高度去甲基化。新近的臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者2型11β-羥類固醇脫氫酶(11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2)基因的啟動子區(qū)域和第1外顯子的CpG島高度甲基化[4, 5]。另外，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶(endothelin-converting enzyme，ECE-1c)的啟動子區(qū)域的甲基化也被認為和高血壓發(fā)生密切相關(guān)[6]。

從以上研究結(jié)果來看，由于采用的技術(shù)手段及研究者視角的局限，只是少數(shù)幾個高血壓相關(guān)基因被有所側(cè)重地分析了DNA甲基化情況，迄今為止，尚未見到全面的對原發(fā)性高血壓相關(guān)基因表觀遺傳學(xué)的研究報道。原發(fā)性高血壓相關(guān)基因是一系列已知和未知的基因群，因此，結(jié)合國外同行的研究報道不難預(yù)測，對原發(fā)性高血壓相關(guān)基因的DNA甲基化狀態(tài)進行全面細致的分析是必要的。本研究高血壓相關(guān)基因的甲基化篩查采用DNA甲基化芯片高通量篩選這一高通量表觀遺傳生物芯片新技術(shù)，使研究者對疾病組織異常的甲基化區(qū)域進行高通量快速篩選成為可能。另外，對初篩后的甲基化異常基因進行亞硫酸氫鈉測序PCR，可以達到進一步精確細篩的目的。

本研究在627個差異甲基化基因中選取FZD7、LRP、TTBK1、USFP1、SYCE1、NDUSF8、ZNF540和ABCG4共8個高血壓相關(guān)基因進行后續(xù)BSP分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8個候選基因中，ABCG4差異甲基化程度最為顯著。原發(fā)性高血壓組ABCG4基因啟動子區(qū)呈相對低甲基化，甲基化率比正常組低14.1%。ABCG4基因是膜轉(zhuǎn)運蛋白ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)家族轉(zhuǎn)運體中G族的第4個成員，定位于染色體11q23.3上，其功能可能被肝X受體和維甲酸X受體調(diào)節(jié)升高，并與調(diào)節(jié)膽固醇外排并轉(zhuǎn)運到高密度脂蛋白中有關(guān)。業(yè)已證實ABC多藥轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的藥物外排對化療藥耐受起主要作用，但其它具體功能及其它特性仍不清楚[7, 8]。通過GenBank序列分析發(fā)現(xiàn)ABCG4基因啟動子區(qū)域存在大量的CpG島，并且本研究證實原發(fā)性高血壓患者ABDG4基因啟動子低甲基化，可以初步提示ABCG4基因低甲基化可能對ABCG4在原發(fā)性高血壓的表達調(diào)控起一定作用，該研究仍需在功能學(xué)上進一步驗證。

[1] Handy DE, Castro R, Loscalzo J. Epigenetic modifications: basic mechanisms and role in cardiovascular disease[J]. Circulation，2011， 123(19): 2145-2156.

[2] 鄧峰美. 原發(fā)性高血壓患者中醫(yī)辨證分型與ACE基因I/D多態(tài)性的相關(guān)性研究[J]. 中國病理生理雜志，2010，26(8): 1545-1548.

[3] Bogdarina I, Welham S, King PJ, et al. Epigenetic modification of the renin-angiotensin system in the fetal programming of hypertension[J]. Circ Res, 2007, 100(4): 520-526.

[4] Alikhani-Koopaei R, Fouladkou F, Frey FJ, et al. Epigenetic regulation of 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 expression[J]. J Clin Invest, 2004, 114(8): 1146-1157.

[5] Friso S, Pizzolo F, Choi SW, et al. Epigenetic control of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2 gene promoter is related to human hypertension[J]. Atherosclerosis, 2008, 199(2): 323-327.

[6] Funke-Kaiser H, Thomas A, Bremer J, et al. Regulation of the major isoform of human endothelin-converting enzyme-1 by a strong housekeeping promoter modulated by polymorphic microsatellites[J]. J Hypertens, 2003, 21(11): 2111-2124.

[7] Huang Y, Sadee W. Membrane transporters and channels in chemoresistance and -sensitivity of tumor cells[J]. Cancer Lett, 2006, 239(2): 168-182.

[8] Oldfield S, Lowry C, Ruddick J, et al.ABCG4: a novel human white family ABC-transporter expressed in the brain and eye[J]. Biochim Biophys Acta, 2002, 1591(1-3): 175-179.

AnalysisofabnormalmethylationinABCG4genepromoterinprimaryhypertension

GUO Jun1, CAI Jun2, LI Zi-cheng1

(1DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China;2HeartCenter,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China.E-mail:zichengli@163.net)

AIM: To analyze the variety of DNA promoter methylation and epigenetic pathogenesis of human primary hypertension.METHODSGenomic DNA was collected from peripheral blood mononuclear cells in normal control group and primary hypertension group. High-throughput screening of 627 diversely-methylated genes was performed by DNA methylation chip. The genes ofFZD7,LRP,TTBK1,USFP1,SYCE1,NDUSF8,ZNF540 andABCG4 were considered as candidate hypertension-related genes and they were analyzed with bisulfite sequencing PCR.RESULTSAmong 8 candidate genes,ABCG4 gene presented the most different DNA methylation. In primary hypertension group, the promoter ofABCG4 gene presented hypomethylation and the percentage of methylation was 18.3%, while that in normal control group was 32.4%(Plt;0.01).CONCLUSIONABCG4 gene promoter presents hypomethylation, suggesting that it may be related to the pathogenesis of primary hypertension.

Methylation; Hypertension; Promoter；Genes,ABCG4

1000-4718(2011)11-2067-05

R544.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.11.004

2011-05-30

2011-08-28

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項目(No.20101174)；暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金資助項目(中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助，No.21610302)；廣東高校育苗工程項目，廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃(No.LYM10030)；暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院重點學(xué)科基金資助項目(暨一臨【2010】4號)

△通訊作者 Tel:020-38688665；E-mail：zichengli@163.net