康潤(rùn)敏，陳曉暉，曾 凱，徐昌文，周英順

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都610066；2.四川大學(xué)動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610064）

長(zhǎng)途運(yùn)輸作為一種應(yīng)激原常常會(huì)導(dǎo)致運(yùn)送的豬只發(fā)生死亡和發(fā)病，Van der Meulen［1］等（2001）證明長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)膽?yīng)激能夠降低腸道內(nèi)pH值，使腸道的滲透性增加，運(yùn)輸結(jié)束后腸道的滲透性達(dá)到最高峰。滲透性的增加導(dǎo)致腸道內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素從腸道遷移至全身血液循環(huán)中，這可能能夠解釋運(yùn)輸后疾病增加的原因［2－3］。2010年9月下旬，因豬場(chǎng)搬遷某集約化養(yǎng)豬場(chǎng)將豬只進(jìn)行長(zhǎng)途運(yùn)輸，豬場(chǎng)搬遷后20日間陸續(xù)出現(xiàn)11頭種豬急性死亡。本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)急性死亡種豬臨床癥狀觀察，并采集急性死亡豬的病料，對(duì)可疑引起豬死亡臨床癥狀和病理解剖變化的病原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，并且進(jìn)行細(xì)菌分離，然后檢測(cè)分離出的細(xì)菌對(duì)18種常見藥物的敏感性試驗(yàn)，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病料的采集 無(wú)菌采集急性死亡種豬的心、肝、脾、肺、腎、腹股溝淋巴結(jié)、腦等病料組織。

1.2 試劑 Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarkerDL－2000，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；藥敏試紙，購(gòu)自廣州市迪景微生物科技有限公司；小鼠，購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 引物 豬瘟病毒引物是根據(jù)報(bào)道的中國(guó)C株E2區(qū)基因設(shè)計(jì)合成一對(duì)豬瘟病毒（Classical swine fever virus）特異性的PCR引物，片度跨幅A/D抗原區(qū)，擴(kuò)增片段為375bp；豬日本乙型腦炎病毒引物根據(jù)GenBank報(bào)道的豬日本乙型腦炎病毒E基因序列并參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段為349bp；偽狂犬病病毒引物根據(jù)GenBank的偽狂犬病病毒gE基因并參考文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì)，擴(kuò)增片段為370bp；豬繁殖與呼吸綜合征病毒按照J(rèn)XA1株為參考設(shè)計(jì)部分NSP2基因?yàn)橐?，?jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴(kuò)增片段為799bp，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴(kuò)增片段為709bp；16SPCR引物參照文獻(xiàn)［6］，擴(kuò)增片段為1 500bp，上述引物序列見表1，上述引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 各病毒引物序列

2 方法

2.1 臨床癥狀 觀察死亡種豬體表狀況，剖檢死亡豬只觀察病死豬心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)以及腦的病理變化。

2.2 病毒檢測(cè) 無(wú)菌采集死豬病料（肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等）剪碎，研磨后，加入滅菌的生理鹽水，制成10%的懸液，－80℃保存用于病毒提?。挥梅勇确路椒ㄌ崛〔×现械腄NA，按Trizol試劑使用說(shuō)明書來(lái)提取樣品的總RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書將樣品的RNA直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成全長(zhǎng)cDNA，將所提取的DNA和反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，其反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 5μL，上/下游引物（50pmol/μL）各1μL，10mmol/LdNTP 2μL，25 mmol/L MgCl22μL，TaqDNA 聚合酶（5U/μL）1μL，滅菌雙蒸水34μL，模板4μL。各病毒的擴(kuò)增條件如下，豬瘟病病毒擴(kuò)增條件：95℃5min；95℃1min，52℃1min，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)，循環(huán)后72℃延伸10min；豬日本乙型腦炎病毒擴(kuò)增條件：94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)后72℃8min；偽狂犬病病毒擴(kuò)增條件：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，循環(huán)后72℃延伸10min；豬繁殖與呼吸綜合征病毒擴(kuò)增條件：94℃3min；94℃40s，57℃45s，72℃5min，共29個(gè)循環(huán)，72℃10 min。

2.3 細(xì)菌分離 將無(wú)菌采集的死豬病料（心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等）分別接種于含10%兔血的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，然后挑取單個(gè)菌落接種于兔血的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上純化培養(yǎng)16h。

2.4 細(xì)菌致病性檢測(cè) 挑取純化的單菌落接種于10mL的血清肉湯中，將肉湯培養(yǎng)基放入37℃搖床中，振蕩培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)液0.2mL注射入健康小鼠腹腔，16h后觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，并將死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離。

2.5 細(xì)菌鑒定 16SrRNA通用引物對(duì)所分離細(xì)菌進(jìn)行鑒定，反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 5μL，上/下游引物（50pmol/μL）各1μL，10mmol/L dNTP 2μL，25mmol/L MgCl22μL，TaqDNA 聚合酶（5U/μL）1μL，滅菌雙蒸水34μL，cDNA模板4μL；16SrRNA擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性1min，然后94℃1min，50℃1min，72℃1min 30s，循環(huán)30周期，最后72℃延長(zhǎng)5min，反應(yīng)結(jié)束后，16SrRNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，陽(yáng)性16SrRNA產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2.6 藥敏試驗(yàn) 挑取純化的細(xì)菌接種于10mL血清肉湯培養(yǎng)基中，將接有細(xì)菌的血清肉湯培養(yǎng)基放入37℃搖床中，振蕩培養(yǎng)12h，取培養(yǎng)液0.2mL均勻涂抹在普通培養(yǎng)基的平板中，再將藥敏紙片均勻的粘貼于培養(yǎng)基上，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）手冊(cè)2005版。

3 結(jié)果

3.1 臨床癥狀 長(zhǎng)途運(yùn)輸后20日內(nèi)，曾出現(xiàn)嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)的成年種豬先后急性死亡11頭，臨床表現(xiàn)為高熱（40℃～41.5℃），白豬全身皮膚表面發(fā)紅，局部斑塊狀紅疹，黑豬皮膚表面呈凸起狀斑塊，呼吸加快，牙關(guān)緊閉，口吐白沫或者血沫。急性死亡后病理變化以皮膚紫癜，以及心臟外膜、肺臟、胃底部、胸前淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)嚴(yán)重出血等癥狀為主。

3.2 病毒檢測(cè) RT－PCR結(jié)果顯示，死豬的病料中并未感染豬瘟病毒，經(jīng)典豬繁殖與呼吸綜合征病毒，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，豬日本乙型腦炎病毒；PCR結(jié)果顯示，死豬的病料中未感染偽狂犬病病毒。

3.3 細(xì)菌分離 病料接種血瓊脂平板中培養(yǎng)24h后，心、肝、脾、肺、腎接種區(qū)域均出現(xiàn)針尖大小菌落，培養(yǎng)48h后菌落呈現(xiàn)無(wú)色透明狀；挑取單個(gè)菌落接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中24h后見極小菌落，培養(yǎng)48h后見菌落長(zhǎng)有針尖大小、菌落呈圓形、平滑、透明；經(jīng)革蘭染色后觀察，各組織分離到的細(xì)菌均為革蘭陽(yáng)性桿菌、無(wú)鞭毛、無(wú)莢膜、形態(tài)極小、兩端鈍圓、部分細(xì)菌可見彎曲狀，并且可見以單個(gè)和鏈狀存在。

3.4 細(xì)菌致病性 注射小鼠后，小鼠于24h發(fā)生死亡，將死亡小鼠進(jìn)行剖檢，取死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果顯示，從死亡小鼠器官中分離的細(xì)菌菌落大小似針尖狀，革蘭染色為陽(yáng)性桿菌，部分可見彎曲狀。

3.5 細(xì)菌檢測(cè) 16SrRNA的產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。使用NCBI中的Blast軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果表明，分離菌株與豬紅斑丹毒絲菌ATCC19414的同源性高達(dá)99%，結(jié)果顯示，病豬是由于感染了豬紅斑丹毒絲菌而導(dǎo)致死亡。

圖1 16SrRNA產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

3.6 藥敏試驗(yàn) 使用18種常見的抗菌藥物對(duì)從病料中分離的豬紅斑丹毒絲菌進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，阿莫西林，氨芐西林，替卡西林，紅霉素，頭孢噻吩，恩諾沙星，頭孢唑啉，環(huán)丙沙星，頭孢噻吩對(duì)分離的丹毒桿菌的抑菌效果好，而分離的丹毒桿菌對(duì)阿米卡星，慶大霉素，新霉素，兩性霉素具有耐藥性。

4 治療

本次通過(guò)診斷結(jié)果進(jìn)行臨床處理，全場(chǎng)進(jìn)行丹巴二連苗（含豬丹毒桿菌G4T10弱毒株和豬多殺巴氏桿菌E0630弱毒株）豬緊急免疫，并且對(duì)出現(xiàn)臨床癥狀的豬只使用藥敏試驗(yàn)中高度敏感的恩諾沙星和阿莫西林，通過(guò)治療和緊急免疫，豬只開始進(jìn)食，病情逐漸好轉(zhuǎn)，通過(guò)1周治療后，病情得到很好的控制。

5 討論

應(yīng)激反應(yīng)是指機(jī)體突然受到強(qiáng)烈有害刺激時(shí)，通過(guò)下丘腦引起血中促腎上腺皮質(zhì)激素濃度迅速升高，糖皮質(zhì)激素大量分泌導(dǎo)致畜禽一系列機(jī)體和代謝的改變。長(zhǎng)途運(yùn)輸往往是引起應(yīng)激反應(yīng)的一個(gè)重要原因，而應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致疾病增加，Berends B R（1996）［7］試驗(yàn)證明運(yùn)輸導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)有可能是導(dǎo)致豬感染沙門菌的主要因素，本試驗(yàn)所研究的種豬急性死亡的病例也是由于種豬經(jīng)過(guò)長(zhǎng)途運(yùn)輸后感染豬紅斑丹毒絲菌而導(dǎo)致的。豬丹毒是由豬紅斑丹毒絲菌又稱為丹毒桿菌引起的一種急性傳染病，廣泛分布于全國(guó)各地?？股厥侵委熂?xì)菌疾病的主要藥物，由于抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素具有耐藥性，本研究通過(guò)藥敏試驗(yàn)證明豬紅斑丹毒絲菌對(duì)阿米卡新，慶大霉素，新霉素和兩性霉素具有耐藥性，其結(jié)果與雷燕［8］結(jié)果相似，但是本研究中豬紅斑丹毒絲菌對(duì)阿莫西林敏感，其結(jié)果與雷燕［8］結(jié)果相反，可能由于豬紅斑丹毒絲菌的菌株不同或者本試驗(yàn)中研究豬紅斑丹毒絲菌，并且本研究中的豬場(chǎng)在平時(shí)疾病治療過(guò)程中并未大量以及時(shí)常使用阿莫西林，這也許是本研究分離的豬紅斑丹毒絲菌對(duì)阿莫西林敏感，而雷燕［8］所分離的豬紅斑丹毒絲菌對(duì)阿莫西林的不敏感的主要原因。

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