趙長(zhǎng)光，宋松林，趙繼勛，張國(guó)中

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 豐臺(tái)100070）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）引起禽類(lèi)的一種急性、高度接觸性傳染病，也是目前嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一。雖然NDV只有一個(gè)血清型，但不同毒株之間的毒力存在明顯差異。有關(guān)NDV毒力及其相關(guān)決定因素的研究一直是世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)，其中反向遺傳學(xué)操作技術(shù)是進(jìn)行NDV毒力相關(guān)基因研究的一種主要技術(shù)手段。本文簡(jiǎn)要綜述了NDV反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建過(guò)程以及利用該技術(shù)在NDV研究中取得的最新成果。

1 反向遺傳操作技術(shù)

反向遺傳學(xué)（reverse genetics）是相對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)而言的。經(jīng)典遺傳學(xué)是從生物的表型、性狀到遺傳物質(zhì)來(lái)研究生命的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律，而反向遺傳學(xué)則是直接從生物遺傳物質(zhì)入手，通過(guò)對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行加工和修飾來(lái)研究基因突變后產(chǎn)生的生物體的特性，從而確定生物體基因組的結(jié)構(gòu)與功能以及這些突變可能對(duì)生物體特性的影響。與之相關(guān)的各種研究技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)（reverse genetics manipulation technique）。

負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)［1］是將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對(duì)RNA病毒進(jìn)行加工、修飾，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來(lái)組裝新的RNA病毒，從而研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能，病毒的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)機(jī)制和致病機(jī)理等的一項(xiàng)研究技術(shù)，也叫全長(zhǎng)感染性cDNA克隆技術(shù)，又稱“病毒拯救”。

2 NDV反向遺傳學(xué)技術(shù)

NDV是單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒，基因組大小約為15.2kb，由3′－NP－P－M－F－HN－L－5′等6個(gè)主要基因組成。NDV的反向遺傳學(xué)研究開(kāi)展得相對(duì)較晚，是在參照其他單股不分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。NDV的第一個(gè)反向遺傳學(xué)研究系統(tǒng)由Peeters等［2］于1999年建立，他們分別將克隆有NDV La－Sota毒株全基因組cDNA（在T7啟動(dòng)子下游）、NP、P以及L基因的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染能表達(dá)T7RNA聚合酶的重組禽痘病毒（FPV/T7）預(yù)感染的CEF或QM5細(xì)胞，成功拯救出具有感染性的NDV。但是利用FPV/T7可能會(huì)影響病毒拯救率和易于誘導(dǎo) RNA重組。為此，Romer－Oberdorfer等［3］將BSR T7/5細(xì)胞系（一種能穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的BHK21細(xì)胞系）引入了NDV反向遺傳學(xué)研究系統(tǒng)，成功拯救出NDV clone30毒株。2001年，Huang等［4］利用人表皮樣癌細(xì)胞（HEp－2）和能表達(dá)T7RNA聚合酶的重組痘病毒（MVA/T7）來(lái)拯救NDV獲得了成功。MVA對(duì)HEp－2細(xì)胞具有嚴(yán)格的宿主特異性，在禽源細(xì)胞和雞胚內(nèi)不能增殖，不會(huì)產(chǎn)生CPE，也不會(huì)干擾病毒的拯救，同樣解決了FPV/T7降低病毒拯救率的問(wèn)題。

NDV拯救的基本路線是將病毒基因組cDNA置于轉(zhuǎn)錄載體T7啟動(dòng)子之后、ε－肝炎病毒核酶基因和T7終止子之前構(gòu)建出轉(zhuǎn)錄載體。同時(shí)構(gòu)建表達(dá)核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）和聚合酶蛋白（L）的輔助表達(dá)載體。然后將轉(zhuǎn)錄載體和3個(gè)輔助表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染能表達(dá)T7RNA聚合酶的痘苗病毒感染的細(xì)胞或直接能表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的T7RNA聚合酶啟動(dòng)全長(zhǎng)病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)載體利用宿主細(xì)胞的酶系統(tǒng)表達(dá)核衣殼蛋白和病毒RNA聚合酶，這些蛋白與病毒基因組RNA結(jié)合后形成具有感染性的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體，從而啟動(dòng)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終組裝成有感染性的病毒粒子［1－2］。目前報(bào)道已有LaSota［2］，Clone30［3］，Beaudette C［5］，Hitchner B1［6］，Herts33［7］和鵝源zJ1［8］等6個(gè) NDV 成功獲得拯救。建立NDV的反向遺傳操作體系主要包括轉(zhuǎn)錄載體和輔助表達(dá)載體的構(gòu)建以及病毒拯救和鑒定等方面的內(nèi)容。

2.1 轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建 轉(zhuǎn)錄載體是通過(guò)反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）擴(kuò)增病毒基因組片段，然后利用限制性酶切位點(diǎn)或重疊PCR的方法將擴(kuò)增的cDNA片段按順序相連于合適的嚴(yán)謹(jǐn)型載體上而獲得的。NDV全長(zhǎng)cDNA基因組較大，通常采用分段擴(kuò)增以及減少PCR循環(huán)次數(shù)的方法來(lái)降低堿基錯(cuò)配率［8］?？寺?gòu)建時(shí)大多采用復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)性較高的低拷貝載體，并在這類(lèi)載體上加上一些其他必要元件，如T7啟動(dòng)子、ε－肝炎病毒核酶基因、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及便于插入外源基因的多克隆位點(diǎn)等。將全長(zhǎng)基因組cDNA置于轉(zhuǎn)錄載體中的T7啟動(dòng)子之后、ε－肝炎病毒核酶基因和T7終止子之前，同時(shí)引入兩個(gè)遺傳標(biāo)記（用于在進(jìn)一步研究中區(qū)分拯救毒株與親本毒株）從而完成轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建［2－3］。

2.2 輔助表達(dá)載體的構(gòu)建 NDV基因組RNA是負(fù)鏈的，不能直接用作轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板。只有當(dāng)基因組RNA與NP、P、L共同形成功能性的RNP復(fù)合體后，才能被RNA依賴的RNA聚合酶識(shí)別并能作為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板［9－10］（圖1）。因此必須構(gòu)建NP、P、L三個(gè)輔助表達(dá)質(zhì)粒。在構(gòu)建輔助質(zhì)粒時(shí)，NP和P基因可經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增后直接連接表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建，L基因由于較長(zhǎng)則需要分段克隆拼接后進(jìn)行構(gòu)建。

圖1 不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒的體內(nèi)拯救病毒示意圖［11］

2.3 病毒的拯救及鑒定 將轉(zhuǎn)錄載體和3個(gè)輔助表達(dá)載體按一定的比例共轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染3d左右收獲細(xì)胞懸液，離心取上清，將上清液通過(guò)尿囊腔途徑接種于9～10日齡的無(wú)特定病原體（SPF）雞胚，培養(yǎng)72～96h后收獲尿囊液，利用血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）進(jìn)行檢測(cè)。尿囊液具有血凝特性并且能夠被抗NDV的特異性單因子血清所抑制，證明病毒拯救成功。拯救的毒株具有親本NDV的特性，同時(shí)含有兩個(gè)和親本病毒相區(qū)別的遺傳標(biāo)記，必要時(shí)可進(jìn)行測(cè)序鑒定［9］。

3 NDV反向遺傳技術(shù)的應(yīng)用

利用NDV反向遺傳技術(shù)可以對(duì)NDV基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行有效研究，同時(shí)NDV也已經(jīng)被開(kāi)發(fā)成為一種常用的病毒載體。

3.1 在病毒致病機(jī)制研究中的應(yīng)用 在cDNA分子水平上對(duì)NDV基因組進(jìn)行加工和修飾，可以分析與NDV致病性相關(guān)的各種蛋白。1999年，Peeters等［2］利用建立的NDV反向遺傳操作系統(tǒng)對(duì)F蛋白裂解位點(diǎn)的功能進(jìn)行了驗(yàn)證性研究。他們將NDV LaSota毒株的F0裂解位點(diǎn)的氨基酸序列從（112GRQGRL117）轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)毒株的序列（112RRQRRF117）時(shí)病毒毒力顯著增強(qiáng)。表明F蛋白裂解位點(diǎn)序列與NDV的毒力有密切關(guān)系。

Mebatslon等［12］（2001）采用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了Clone30的感染性分子克隆，并據(jù)此構(gòu)建了3個(gè)突變株：NDVP1（NDV P基因保守序UUUUUCCC突變?yōu)閁UCUUCCC）、NDV△6（V區(qū)缺失6個(gè)堿基）、NDV－Vstop（V區(qū)加入終止密碼子）。與親本毒相比，NDVP1突變體V蛋白的表達(dá)量下降20倍，在雞胚上的產(chǎn)量降低100倍。NDV△6、NDVVstop中的突變則可導(dǎo)致V蛋白的產(chǎn)生徹底停止，突變株不能在雞胚上進(jìn)行復(fù)制。研究結(jié)果表明V蛋白對(duì)NDV的復(fù)制是必需的。

Angela等［13］（2003）利用反向遺傳技術(shù)證實(shí)HN基因的不同長(zhǎng)度與NDV的毒力和致病性有著非常重要的關(guān)系。2005年，de Leeuw等［7］在獲得強(qiáng)毒株Herts/33感染性克隆FL－Herts的基礎(chǔ)上，將它與NDFLtag（LaSota的F0蛋白切割位點(diǎn)序列變成強(qiáng)毒株的序列）進(jìn)行了一系列基因替換。重組病毒NDFLtag（HN）Herts（NDFLtag的 HN基因被強(qiáng)毒株Herts/33的HN基因替換）的腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）和靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)（IVPI）均較親本毒NDFLtag顯著升高，同樣說(shuō)明HN蛋白是影響NDV致病力的重要蛋白。

Wakamatsu等［14］（2006）在雞體內(nèi)進(jìn)一步研究了F、HN以及P蛋白與NDV致病力的關(guān)系。他們對(duì)rBC LaSotaHN（中等毒力毒株Beaudette C的HN基因被LaSota株替換）、rLaSota BCHN（LaSota株的 HN基因被Beaudette C株替換）、rLaSotaVF BCHN（LaSota株F0蛋白裂解位點(diǎn)序列變?yōu)閺?qiáng)度株裂解位點(diǎn)得到重組毒株rLaSotaVF的HN基因被 Beaudette C株替換）、rBC/V－Stop（不表達(dá)V蛋白）和rBC/Edit（V蛋白和 W蛋白都不表達(dá)）的致病性變化進(jìn)行了測(cè)定和分析，結(jié)果表明不僅F蛋白和HN蛋白是NDV致病力的重要分子基礎(chǔ)，HN蛋白與F蛋白的相互作用對(duì)NDV的致病力影響也較大。研究結(jié)果還進(jìn)一步表明P基因編碼的兩個(gè)蛋白V和W也均與NDV的致病力相關(guān)。

NDV反向遺傳研究系統(tǒng)的建立極大地促進(jìn)了NDV致病機(jī)制的研究。前人通過(guò)將NDV的HN、F、P基因編碼區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變、基因片段替換等已初步確定了NDV中HN、F、P等基因與致病機(jī)制的關(guān)系。但關(guān)于NDV致病機(jī)制方面仍有許多未知因素亟需探索和研究。

3.2 在病毒載體研究中的應(yīng)用 Krishnamurphy等［5］（2000）將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）插人到中等毒力毒株Beaudette C株HN基因和L基因之間。與親本株相比，重組病毒雖然在雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）上的復(fù)制速度和產(chǎn)量均有所下降，但該重組病毒在傳了8代后仍能穩(wěn)定表達(dá)CAT，結(jié)果表明NDV可以作為外源基因的表達(dá)載體。

Engel－Herbert等［15］（2003）把綠色熒光蛋白（GFP）基因插入新城疫病毒Clone30毒株基因組的F基因和HN基因之間獲得了重組病毒rNDVGFP1。rNDV－GFP1在雞胚中可穩(wěn)定表達(dá)GFP，并且其在雞胚中的增殖能力以及對(duì)雞胚的致病性與親本Clone30毒株均無(wú)明顯區(qū)別。利用GFP的自發(fā)熒光特性，可以很容易的在器官和組織中發(fā)現(xiàn)感染的細(xì)胞，因此能夠更清楚地了解NDV在體內(nèi)的分布情況，顯示了NDV作為疫苗載體的巨大潛力。

Zhao等［16］（2003）對(duì) NDV 作為載體的可行性進(jìn)行了深入研究。他們將堿性磷酸酶基團(tuán)（SEAP）分別插入 NDV 病毒的 NP－P、M－F、HN－L、基因組5，端，結(jié)果除了基因組5，端這個(gè)位置，SEAP被插入前三個(gè)位置，無(wú)論是在細(xì)胞上還是在雞胚上都能得到高效表達(dá)且活性不受影響。從外源基因插入NDV的位置來(lái)看，其插入位置越接近NDV基因組的3′末端，其病毒蛋白表達(dá)水平有可能越高。

3.3 在新型疫苗研究中的應(yīng)用 2001年，Nakaya等［6］把流感病毒 A/WSN/33的 HA 基因插入到NDV弱毒株Hitchner B1基因組的P基因和M基因之間，獲得了含有流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rNDV/B1－HA。rNDV/B1－HA在雞胚連續(xù)傳10代后仍能穩(wěn)定地表達(dá)流感HA蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦顯示重組rNDV/B1－HA對(duì)小鼠沒(méi)有毒性，而且能保護(hù)小鼠免受A/WSN/33的致死性攻擊。

2004年，Huang等［17］采用體內(nèi)復(fù)制能力較強(qiáng)、免疫原性良好的LaSota疫苗株為載體，構(gòu)建了表達(dá)傳染性囊病病毒（IBDV）變異株GLS－5VP2基因的重組新城疫病毒rLaSota/VP2，利用該重組株免疫2日齡SPF雛雞可有效抵御IBDV變異株及新城疫強(qiáng)毒的攻擊，保護(hù)率均達(dá)到100%。

2009年，胡順林等［18］利用反向遺傳技術(shù)將NDV強(qiáng)毒株ZJ1的F裂解位點(diǎn)序列進(jìn)行改造，成功拯救出重組毒株NDV/ZJ1HN。利用NDV/ZJ1HN免疫2周齡雞，免疫后4周用基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒可獲得比傳統(tǒng)疫苗LaSota株更好的免疫保護(hù)，提示NDV/ZJ1HN有可能作為一個(gè)理想候選疫苗株用于生產(chǎn)中對(duì)基因Ⅶ型NDV流行株的防控。

Nayak等［19］（2009）將 H5N1高致病性禽流感病毒A/Vietnam/1203/2004的血凝素（HA）基因插入到NDV LaSota株中，獲得了含有禽流感病毒HA基因的重組新城疫病毒rNDV－HA，利用rNDV－HA免疫14日齡SPF雛雞，免疫后3周對(duì)新城疫強(qiáng)毒及H5N1亞型禽流感病毒均具有較好的保護(hù)。

NDV在人用活載體疫苗中也有應(yīng)用。Di－Napoli等［20］（2007）將 SARS－CoV 的 S 蛋 白 插 入NDV弱毒株的P－M位點(diǎn)，證實(shí)其在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中具有較好的免疫原性和保護(hù)性，是一種非常有潛力的疫苗載體。

4 現(xiàn)狀與展望

NDV反向遺傳技術(shù)的研究既有利于NDV結(jié)構(gòu)和功能的研究，又有利于新型基因工程疫苗的研制。盡管NDV拯救工作難度相對(duì)較大，近年NDV的反向遺傳學(xué)相關(guān)研究仍取得了許多驕人的成績(jī)，相信隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與完善，其在NDV等重大動(dòng)物疫病的致病機(jī)理及預(yù)防控制等方面將會(huì)取得更大的成績(jī)。

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