方 敬，仇新軍，閆翠環(huán)，陳志強

河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合研究所，石家莊050017

青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理及ICAM-1表達的影響

方 敬，仇新軍，閆翠環(huán)，陳志強*

河北醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合研究所，石家莊050017

為探討青藤堿(Sinomenine，SIN)對實驗性系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)的病理形態(tài)學改善及腎組織中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達的影響，通過實驗建立改良的慢性血清病性MsPGN動物模型，光鏡觀察腎小球以及腎小管-間質(zhì)的病理改變情況，采用免疫組織化學法檢測ICAM-1的表達并分別進行半定量分析。結(jié)果顯示:光鏡下，模型組與正常組相比，系膜基質(zhì)指數(shù)顯著升高(P＜0.01)，腎小球毛細血管直徑明顯縮小(P＜0.01);青藤堿組與模型組相比，上述病理改變明顯減輕，系膜基質(zhì)指數(shù)顯著下降(P＜0.01)，腎小球毛細血管直徑明顯改善(P＜0.01)。腎組織中ICAM-1免疫組化結(jié)果顯示青藤堿可明顯 下調(diào)ICAM-1的表達，腎組織ICAM-1的相對含量、積分光密度，均顯著下降(P＜0.01)，青藤堿組與雷公藤多苷組相比，二者無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。實驗表明青藤堿能夠有效減輕腎臟病理損害，抑制MsPGN大鼠腎組織ICAM-1的表達，延緩疾病進展。

青藤堿;系膜增生性腎小球腎炎;細胞間粘附分子-1

系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)是以系膜細胞(mesangial cells，MC)增生和系膜區(qū)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)聚積和擴增為主要病理改變的一類腎小球疾病，在我國約占原發(fā)性腎小球疾病腎活檢病理的一半［1］，多見于16～30歲的兒童和青年人。目前，西醫(yī)主要采用免疫抑制劑和細胞毒藥物治療，臨床療效不理想，因此，開展MsPGN的研究，積極尋找抑制MC增生和ECM聚積的藥物，對延緩腎小球疾病進展、防止腎衰具有重要的意義。

本實驗旨在通過觀察青藤堿對MsPGN大鼠腎臟病理形態(tài)學的影響，明確青藤堿在MsPGN病理過程中的干預作用，并通過觀察與MsPGN病理改變過程有密切關(guān)系的細胞間粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達情況，探討青藤堿防治MsPGN的部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級健康雄性SD系大鼠共40只，體重130～170 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號:冀醫(yī)動管字第04057。

1.2 試劑

兔抗大鼠ICMA-1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號BA0541);SP(二抗為羊抗兔)試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司，批號SP9001)。DAB顯色劑(北京中山生物技術(shù)有限公司，批號ZLI9032)其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 模型制備

動物隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、青藤堿組和雷公藤多苷組，采用改良的慢性血清病性MsPGN模型，10%的水合氯醛麻醉后，經(jīng)背部切除左側(cè)腎臟，休養(yǎng)一周后，進行預免疫，于每只大鼠背部皮下分點注射完全弗氏佐劑0.1 mL加牛血清白蛋白(BSA)3.0 mg，于第1、2周末背部皮下注射不完全弗氏佐劑0.1 mL加BSA 3.0 mg，3周后腹腔注射BSA連續(xù)4次，每次間隔1 h，注射劑量每只分別為0.5、1、1.5、3.0 mg，次日每只腹腔注射BSA 2.0 mg。第4周正式免疫:尾靜脈與腹腔注射隔日進行，每只大鼠尾靜脈注射BSA劑量從0.5 mg開始，每次注射增加0.5 mg，至2.5 mg為止，繼續(xù)每周加量0.5 mg，至每日用量5.0 mg為止，腹腔注射量是尾靜脈注射量的1倍，至每日用量10.0 mg為止，免疫兩周后尾靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素(LPS) 100 ug/只，全部大鼠于正式免疫8周后處死取腎組織。

1.4 實驗用藥及方法

采用直接灌胃方法，于實驗第4周開始灌胃給藥，每日1次，青藤堿組采用正清風痛寧(白云山正清制藥股份有限公司，批號:9911105)，服藥量為30 mg/Kg.d，按成人/Kg.d劑量的15倍給藥;雷公藤多苷組采用雷公藤多苷片(湖南省株洲市制藥三廠，批號:Z43020138)服藥量為20 mg/Kg.d，按成人/Kg.d劑量的15倍給藥，正常組灌以相應(yīng)量的自來水。各組灌胃共4周。

1.5 腎組織標本制作及觀察

1.5.1 光鏡

實驗第8周末，無菌下取右腎組織，HE、PAS染色，鏡下觀察拍片，并進行半定量分析。取PAS染色的腎組織切片，置于顯微鏡下，使用HPIAS-2000型全自動彩色圖象分析系統(tǒng)進行分析。測定方法，每組隨機選取6只大鼠的PAS切片，將PAS染色切片鏡下放大400倍，每張切片至少選取20個腎小球進行測量。測定參數(shù)為腎小球面積、系膜區(qū)面積以及毛細血管腔直徑，然后求出系膜區(qū)面積與腎小球面積的百分比(此值為腎小球系膜基質(zhì)相對面積，也稱系膜基質(zhì)指數(shù))，以及腎小球毛細血管腔直徑均值。

1.5.2 免疫組織化學染色

采用SABC法觀察腎小球中ICMA-1的變化，并進行半定量分析。腎小球內(nèi)表達:采用HMIAS-2000型高清晰度彩色病理圖象分析系統(tǒng)，在400倍光鏡下測量每個腎小球的面積以及陽性染色面積和染色強度(積分光密度)。用陽性染色面積和腎小球面積的百分比表示該成分的相對含量。每組選取6只大鼠標本，每個標本測量10個完整腎小球進行半定量分析。腎小管的表達:選用標本數(shù)及分析系統(tǒng)同上。檢測每張切片10個視野，計算每個視野陽性染色面積以及顯示屏面積，陽性染色面積和顯示屏面積的比值為相對含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察結(jié)果

正常組腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細血管腔開放，系膜無增生，腎小管及間質(zhì)無異常。模型組的多數(shù)腎小球系膜區(qū)明顯增寬，有的腎小球毛細血管腔受壓變窄或閉塞，甚至個別腎小球萎縮纖維化。部分腎小管上皮細胞腫脹、管腔狹窄，間質(zhì)有炎細胞浸潤。青藤堿組和雷公藤多苷組腎小球系膜區(qū)的寬度明顯小于模型組，腎小球毛細血管腔呈開放狀態(tài)。兩治療組腎小管及間質(zhì)均無明顯異常。腎小球毛細血管基底膜在光鏡下觀察，四組均無明顯的變化。

2.2 腎組織病理形態(tài)半定量圖像分析結(jié)果(見表1)

2.2.1 各組大鼠腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)的比較

結(jié)果顯示:模型組與正常組比較，系膜基質(zhì)指數(shù)顯著升高(P＜0.01)，青藤堿組和雷公藤多苷組與模型組相比，系膜基質(zhì)指數(shù)明顯下降(P＜0.01)，青藤堿組和雷公藤多苷組相比，無明顯差異(P＞0.01)。

2.2.2 各組大鼠腎小球毛細血管腔直徑的比較

結(jié)果顯示:模型組與正常組比較，腎小球毛細血管腔直徑顯著縮小(P＜0.01)，青藤堿組和雷公藤多苷組與模型組相比，腎小球毛細血管腔直徑明顯大于模型組(P＜0.01)，青藤堿組和雷公藤多苷組之間無顯著性差異(P＞0.05)見表1。

表1 各組大鼠腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)和腎小球毛細血管腔直徑的比較(±s，n=6)Table 1 Comparison of the mesangial matrix index and capillary lumen diameter(±s，n=6)

表1 各組大鼠腎小球系膜基質(zhì)指數(shù)和腎小球毛細血管腔直徑的比較(±s，n=6)Table 1 Comparison of the mesangial matrix index and capillary lumen diameter(±s，n=6)

注:與正常組比較△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組比較 *P＜0.05，＊＊P＜0.01。下同。Note:△P＜0.05，△△P＜0.01 vs normal group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group.The same below.

組別Group系膜基質(zhì)指數(shù)Mesangial matrix index(%)毛細血管腔直徑Capillary lumen diameter(μm) Normal 6.28±1.61 14.17±1.12模型組Model 32.46±4.63△△ 9.16±0.88△△青藤堿組SIN 20.66±1.64△△＊＊ 12.12±0.52＊＊雷公藤多苷組TWP 20.37±1.42△△＊＊ 12.16±0.78正常組△△＊＊

2.3 免疫組化檢驗結(jié)果

2.3.1 各組大鼠腎組織ICAM-1表達及其分布

正常組ICAM-1分布很少，僅少量表達，著色淺淡。與正常組相比，模型組ICAM-1表達的范圍和強度明顯擴大和增強，主要分布在腎小球系膜細胞、腎小球的血管內(nèi)皮細胞、某些腎小囊的上皮細胞及小管間質(zhì)部位，呈棕黃色顆粒，表達較強。與模型組相比，兩治療組表達降低，呈中度表達。

2.3.2 各組大鼠腎組織ICAM-1半定量分析:

青藤堿組和雷公藤多苷組與模型組相比相對含量、積分光密度，均顯著下降(P＜0.01)，提示青藤堿組和雷公藤多苷組均可抑制MsPGN腎小球ECM中ICAM-1的過度表達;青藤堿組和雷公藤多苷組比較，ICAM-1的表達不論是相對含量、還是積分光密度，均無顯著性差異(P＞0.05)，見表2和3。

3 討論

我們選用鄒氏造模法并進行改良制備MsPGN模型［2］，實驗結(jié)果表明，青藤堿可以抑制腎小球系膜細胞增殖，系膜基質(zhì)積聚，延緩病變進展，其作用機制可能與該藥抑制ICAM-1的表達有關(guān)。

表2 腎小管中ICAM-1的相對含量、積分光密度的半定量分析(±s，n=6)Table 2 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in renal tubule(±s，n=6)

表2 腎小管中ICAM-1的相對含量、積分光密度的半定量分析(±s，n=6)Table 2 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in renal tubule(±s，n=6)

積分光密度相對含量Relative amount(%)組別Group Normal 1.11±0.50 1.37±0.52模型組Model 12.11±3.76△△ 5.67±0.72△△青藤堿組SIN 5.74±1.38△△＊＊ 4.32±0.44△△＊雷公藤多苷組TWP 5.32±1.11△△＊＊ 3.81±0.37 Density正常組△△＊＊

表3 腎小球中ICAM-1的相對含量、積分光密度的半定量分析(±s，n=6)Table 3 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in glomerulus(±s，n=6)

表3 腎小球中ICAM-1的相對含量、積分光密度的半定量分析(±s，n=6)Table 3 Comparison of relative amount and density of ICAM-1 in glomerulus(±s，n=6)

積分光密度Normal 1.09±0.27 1.00±0.28模型組Model 10.03±2.99△△ 5.22±0.84△△青藤堿組SIN 4.52±0.64△△＊＊ 3.63±0.63△△＊雷公藤多苷組TWP 4.68±0.55△△＊＊ 3.49±0.55 Density正常組組別Group相對含量Relative amount(%)△△＊＊

ICAM-1與腎臟炎性病變有著密切關(guān)系，在生理情況下，ICAM-1通常以低水平表達于腎臟大血管的內(nèi)皮細胞、包曼氏囊上皮細胞、腎小球系膜細胞、腎小管周圍毛細血管內(nèi)皮細胞，偶見于間質(zhì)細胞［3］，也有認為腎小管間質(zhì)無表達［4］。當發(fā)生免疫反應(yīng)時，受各種刺激因素包括維甲酸、病毒感染、氧應(yīng)急、內(nèi)毒素、和多種致炎因子如白介素-1、腫瘤壞死因子和干擾素等均可上調(diào)ICAM-1的表達，通過ICAM-1與淋巴細胞功能相關(guān)抗原(lymphocytefunctionassociatedantigen-1，LFA-1)等的相互作用，導致淋巴細胞、巨噬細胞與高表達ICAM-1的各種內(nèi)皮/上皮細胞發(fā)生粘附，使炎癥細胞粘附并進一步移入組織，引起一系列的炎癥免疫反應(yīng)。研究已證明［5］在非IgA系膜增生性腎小球腎炎和IgA腎病的腎臟病理活檢標本中，ICAM-1的表達彌散分布于系膜區(qū)，廣泛分布于腎小管周圍毛細血管的內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞、浸潤的炎癥細胞和腎小管的上皮細胞中，特別在病變的腎小管上皮細胞上表達強烈，并且在腎小球和腎小管間質(zhì)中，淋巴細胞功能相關(guān)抗原陽性細胞數(shù)量的增多與ICAM-1的表達明顯相關(guān)，與腎小球和腎小管間質(zhì)中浸潤的單核細胞、巨噬細胞的數(shù)量明顯相關(guān)。孫艷玲等［6］實驗結(jié)果表明腎缺血再灌注后ICAM-1在腎小球毛細血管、系膜區(qū)及間質(zhì)中大量表達。

本實驗結(jié)果證實在正常大鼠腎組織中，ICAM-1分布很少，在MsPGN大鼠腎組織中，ICAM-1主要分布于腎小球系膜細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞，在腎小管間質(zhì)部位也有大量表達，呈棕黃色顆粒，青藤堿組的染色面積與模型組相比有明顯差異，能明顯減少MsPGN大鼠腎組織中的陽性表達，提示青藤堿確實有效減緩MsPGN大鼠腎臟炎癥反應(yīng)。

綜上所述，青藤堿通過下調(diào)ICAM-1的表達，從多種途徑作用于腎組織，改善MsPGN大鼠腎臟病理改變，保護腎功能，而且毒副作用小，值得進一步研究開發(fā)利用。

1 Lu ZY(陸再英).Internal Medicine(內(nèi)科學).Beijing:People’s Medical Publishing House，2001.534-535

2 Jia H(賈慧)，Zou WZ(鄒萬忠).An improved animal model for mesangioproliferative giomerulonephritis in rat.Chin J Nephrol Dial Transplant(腎臟病與透析腎移植雜志)，1996，534(3):21-25.

3 Zhang SH(張舜華).ICAM-1 and diabetes nephrosis.Foreign Med Sci(Urol Nephrol Foreign Med Sci)(國外醫(yī)學·泌尿系統(tǒng)分冊)，2005，25:700-703.

4 Zhao JH(趙佳慧).ICAM-1 and kidney disease.Foreign Med Sci(Urol Nephrol Foreign Med Sci)(國外醫(yī)學泌尿系統(tǒng)分冊)，2003，23:102-105.

5 Shida-Y，Oda-H，Yorioka-N.Tumor necrosis factor-alpha and IgA nephropathy.Kidney Int，1999，71(5):1-3.

6Sun YL(孫艷玲)，Wu WZ(吳五洲)，Liu XY(劉先義)，et al.Effects of shenfu injection on expression of NF-κB，TNF-α and ICAM-1 after renal ischemia reperfusion in rats.Chin J Clin Pharm Ther(中國臨床藥理學與治療學)，2008，13: 1005-1009.

Affection of Sinomenine on the Kidney Pathology and Expression of ICAM-1 in the Rats with Mesangial Proliferative Glomerulonephritis

FANG Jing，QIU Xin-jun，YAN Cui-huan，CHEN Zhi-qiang*
Institution of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China

To explore affection of Sinomenine(SIN)on the kidney pathology and Intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)expression in rats with mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN).The test uses the improvement chronic serum sickness nature MsPGN model，with the light mirror observing mesangial region and kidney tubules-mesenchyma，using immunohistochemical method observe the expression of ICAM-1，at the same time，carries on the semidefinite quantity analysis with the pathology image analysis system.The results showed that compared with the normal group，mesangial matrix index(%)remarkably heighten(P＜0.01)and capillary lumen diameter(μm)obviously reduce.Compard with the model group，in SIN group，mesangial matrix index(%)remarkably reduce(P＜0.01)and capillary lumen diameter(μm)obviously improve(P＜0.01).In the nephridial tissue immunohistochemistry result showed that SIN can obviously reduce Relative amount(%)and Density expression(P＜0.01).Comparing between two treatments groups，although the result of SIN group is lower than TWP group but the two comparison have no the remarkable difference(P＞0.05).This result suggested that SIN can effectively reduce the kidney pathological lesion，refrain the expression of ICAM-1.

sinomenine;mesangial proliferative glomerulonephritis(MsPGN);Intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1)

1001-6880(2011)03-0436-04

2010-08-31 接受日期:2010-12-24

河北省中醫(yī)藥管理局課題(2009001)

*通訊作者 Tel:86-311-86265113;E-mail:fangjing1102@126.com

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