姚梅芬，王岳峰，李 展，潘瑞樂(lè)，趙曉宏，斯建勇*

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193，2西南交通大學(xué)藥學(xué)院，成都610031

反相高效液相色譜法測(cè)定升麻藥材中升麻苷H-1的含量

姚梅芬1，2，王岳峰2，李 展1，潘瑞樂(lè)1，趙曉宏1，斯建勇1*

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193，2西南交通大學(xué)藥學(xué)院，成都610031

建立升麻藥材中升麻苷H-1含量測(cè)定的反相高效液相色譜分析方法。使用H＆E XP ODS-A色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4)，流速為1 mL/min，柱溫為26℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。測(cè)得升麻苷H-1線(xiàn)性范圍為0.95～28.5 μg/mL(r=0.9999)，平均回收率(n=6)為99.35%(RSD= 2.79%)，不同來(lái)源批次升麻藥材含量測(cè)定結(jié)果表明，升麻藥材中升麻苷H-1含量為0.53%～1.09%，綜合分析批樣品含量測(cè)定結(jié)果，建議升麻藥材中含升麻苷H-1應(yīng)不低于0.4%。本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可作為升麻藥材質(zhì)量控制方法。

升麻;升麻苷H-1;高效液相色譜法;含量測(cè)定

升麻為常用中藥，《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部收載的升麻藥材有三種，分別為毛茛科植物大三葉升麻Cimicifuga heracleifolia kom.、興安升麻C.dahurica(Turcz.)Maxim.或升麻 C.foetida L.。升麻具有清熱解毒、升舉陽(yáng)氣、發(fā)表透疹的功效，主治風(fēng)熱頭痛、齒痛、咽喉痛、子宮脫垂等癥［1］。升麻根莖中主要含有三萜及其甙類(lèi)、苯丙酸類(lèi)、色酮類(lèi)及其它類(lèi)型的化合物［2］。阿魏酸和異阿魏酸等苯丙酸衍生物具有抗炎活性，一般認(rèn)為是升麻清熱解毒的有效成分，并以所含阿魏酸和異阿魏酸為指標(biāo)控制其質(zhì)量［3，4］.近年的研究表明升麻中所含的三萜類(lèi)成分具有解毒、抑制核苷運(yùn)轉(zhuǎn)、抗病毒和治療婦女更年期綜合癥及抗骨質(zhì)疏松等活性［2，5］，以三萜皂苷27-脫氧升麻亭(27-deoxyactein)為指標(biāo)測(cè)升麻中的含量已有報(bào)道［6］，但經(jīng)比較分析，我們發(fā)現(xiàn)升麻苷H-1在升麻中的含量較高，易檢出，以升麻苷H-1指標(biāo)控制其質(zhì)量，更為合理。本文將以 RPHPLC法對(duì)不同品種、不同產(chǎn)地升麻中三萜皂苷升麻H-1(cimicifugoside H-1)的含量進(jìn)行測(cè)定，為升麻藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(Waters 600 Controller，AF在線(xiàn)脫氣機(jī)，Waters 2987紫外檢測(cè)器，CBL 100柱溫箱，Empower色譜工作站);超聲清洗儀(KQ5200B，昆山超聲儀器設(shè)備廠);電子天平HANGPING FA1104(上海天平儀器廠)，VV2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph)。乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

升麻苷H-1對(duì)照品自制，經(jīng)UV、IR、MS、1H和13C NMR確認(rèn)結(jié)構(gòu)為升麻苷H-1(cimicifugoside H-1)［7］，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計(jì)算純度＞98.7%。實(shí)驗(yàn)所用升麻樣品為采集或市售，經(jīng)藥用植物研究所林余霖教授鑒定。

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱:H＆E XP ODS-A色譜柱(4.6×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4);流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):203 nm;柱溫26℃，進(jìn)樣量20 μL;采集時(shí)間:60 min。在此色譜條件下升麻苷H-1對(duì)照品和升麻樣品色譜圖見(jiàn)圖1。在色譜圖中升麻苷H-1的保留時(shí)間為26 min，與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)為17000。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取升麻皂苷H-1對(duì)照品10 mg，加色譜甲醇制成每1 mL含升麻皂苷H-1 0.1 mg，的溶液，搖勻，即得。

1.4 供試液的制備

取本品粉末(過(guò)2號(hào)篩)約1 g，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，電熱套加熱回流沸騰1 h，放冷，稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 線(xiàn)性范圍考察

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的對(duì)照升麻苷H-1 1.9 mg至1 mL容量瓶中，用色譜純甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得對(duì)照品貯備溶液，精密吸升麻苷H-1貯備溶液0.5、1、2、5、10、15 μL按正文色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理，升麻苷H-1線(xiàn)性回歸方程為:y=780100x–1524.5，r =0.9999。本法的線(xiàn)性范圍為0.95～28.5 μg/mL，最低定量限(S/N≥10)為0.038 μg/mL，以信噪比(S/N≥3)測(cè)得最低檢測(cè)限為0.0095 μg/mL。

2.2 檢測(cè)方法及檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

我們采用HPLC-UV-ELSD的方法進(jìn)行測(cè)定，發(fā)升麻苷H-1有紫外吸收，考慮到紫外檢測(cè)法的靈敏度較高、儀器普及率高，我們排除蒸發(fā)光檢測(cè)法，確定采用紫外檢測(cè)法。利用UV-2102 PC型紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)(190～1000 nm)掃描。結(jié)果顯升麻苷H-1在203 nm處存在末端吸收，所以我們就確定203 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 關(guān)于流動(dòng)相的確定

我們比較了不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-磷酸等系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.4)系統(tǒng)分離效果較好。

2.4 提取方法考察

取升麻粉末(過(guò)2號(hào)篩)約1 g，精密稱(chēng)定，置平底燒瓶中，精密加入甲醇/乙醇50 mL，稱(chēng)定重量，分別考察回流、超聲兩種提取方法，分別考察提取時(shí)間(30、60、90、120 min)考察提取溶劑(甲醇、乙醇)樣品處理完以后，放冷稱(chēng)定重量，用甲醇/乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，既得。用HPLC-UV檢測(cè)，測(cè)得樣品峰面積從而計(jì)算得樣品中升麻苷H-1的含量。在相同時(shí)間60 min、相同溶劑甲醇的條件下考察超聲和回流兩種方法，結(jié)果表明回流提取所得升麻苷H-1的含量比較高;在提取方法一定，提取時(shí)間一定的條件下，即回流提取1h考察溶劑乙醇和甲醇，得出甲醇提取的升麻苷H--1含量比較高;在提取方法為回流和提取溶劑為甲醇條件一定時(shí)考察提取時(shí)間(30、60、90、120 min)，結(jié)果表明回流120 min比回流60 min所得的升麻苷H-1的含量稍高，不具顯著性;綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明升麻苷H-1的含量為指標(biāo)用甲醇加熱回流60 min最為合理。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20.0 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積積分值的RSD，升麻苷H-1的RSD為1.1%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批藥材6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄升麻苷H-1的色譜峰面積值，計(jì)算升麻苷H-1的含量平均值(n= 5)為0.66%，RSD為2.67%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20 μL，按上述色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明含量在24 h內(nèi)基本不變，其RSD(n=6)為0.1%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量生藥樣品6份各約0.5 g，對(duì)照升麻苷H-1 6份各約2 mg，先將對(duì)照品用甲醇溶解，定溶至50 mL，然后注入樣品粉末，按供試液制備并測(cè)定。進(jìn)HPLC分析并計(jì)算回收率(n=6)，結(jié)果升麻苷H-1平均加樣回收率為99.35%，RSD為2.79%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery test

2.9 樣品測(cè)定

用微量進(jìn)樣器精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，供試品溶液20 μL注入HPLC儀，外標(biāo)法定量。共測(cè)定29批樣品，其中收集到7批興安升麻和大三葉升麻樣品升麻苷H-1含量很低，升麻升麻苷H-1的含量在0.56%～1.09%，故建議升麻升麻苷H-1的含量規(guī)定為:不得少于是0.4%升麻苷H-1的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)照品、樣品HPLC色譜圖見(jiàn)附圖1。

表2 不同品種升麻中升麻苷H-1的含量Table 2 Contents of cimicifugoside H-1 in various producing area and species of Rhizoma Cimicifugae

SM14 甘肅宕昌(升麻) 0.61 SM15 甘肅舟曲(升麻) 0.55 SM16 甘肅武都(升麻) 0.77 SM17 甘肅武都(升麻) 0.71 SM18 甘肅武都(升麻) 0.78 SM19 甘肅武都(升麻) 0.77 SM20 甘肅武都(升麻) 0.63 SM21 甘肅武都(升麻) 0.70 SM22 甘肅武都(升麻) 0.66 SM23 甘肅武都(升麻) 0.61 SM24 甘肅武都(升麻) 0.78 SM25 甘肅武都(升麻) 0.71 SM26 甘肅武都(升麻) 0.76 SM27 甘肅舟曲(升麻) 0.63 SM28 甘肅舟曲(升麻) 0.79 SM29 甘肅舟曲(升麻) 1.09

圖1 對(duì)照品及供試品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A) and sample(B)

3 結(jié)論

升麻質(zhì)量控制探討研究發(fā)現(xiàn)不同品種升麻所含的異阿魏酸的量有很大差別，升麻中異阿魏酸含量較低，有些甚至檢測(cè)不出異阿魏酸，而興安升麻和大三葉升麻中異阿魏酸含量較高。由于升麻總皂苷(希明婷片)已經(jīng)用于臨床治療婦女期綜合征而且升麻中含有異阿魏酸較少，因此我們建議選擇升麻中含量較高的升麻皂苷H-1作為控制升麻的質(zhì)量指標(biāo)，而興安升麻以及大三葉升麻含有升麻苷H-1很少，仍然選擇異阿魏酸作為控制升麻的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。從含量測(cè)定的結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地升麻升麻苷H-1含量介于0.53%～1.09%，其中以甘肅舟曲的升麻藥材升麻苷H-1含量最高。根據(jù)對(duì)21批升麻藥材升麻苷含量測(cè)定的結(jié)果，建議升麻藥材中升麻苷的含量不應(yīng)低于0.4%。含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性，可用于升麻藥材的質(zhì)量控制，為保證臨床用藥的安全，提供了科學(xué)、可靠的依據(jù)。

1 Pharmacopoeia commission of the People's Republic of China.Part I(中國(guó)藥典2005版，一部)，2005.50.

2 Lin YP(林玉萍)，Qiu MH(邱明華)，Li ZR(李忠榮).Studies on the chemical constituents and biological activities of Cimicifuga.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2002，14:58.

3 Liu Y(劉穎)，Zhang XX(張小茜).Resrarch on the quality of Rhizoma Cimicifugae.Chin Tradit Herb Drug(中草藥)，2005，36:1402-1404.

4 Pan RL(潘瑞樂(lè))，Chen DH(陳迪華)，Shen LG(沈連鋼)，et al.Determination of ferulic acid and isoferulic acid in Rhizoma Cimicifugae by HPLC.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2000，20:396-398.

5Hu P(胡平)，Zhong TY(鐘廷瑜)，Shu GM(舒光明).Development and utilization of Cimicifuga plants in Sichuan and Chongqing area.Resour Dev Market(資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng))，2005，21:544.

6 Pan RL(潘瑞樂(lè))，Chen DH(陳迪華)，Si JY(斯建勇)，et al.Determination of 27-deoxyactein in various specimens of Rhizom Cimicifugae by RP-HPLC.Central South Pharm(中南藥學(xué))，2007，6:206-208.

7 Koeda M，Aoki Y，Sakurai N，et al.Studies on the Chinese crude drug"shoma."IX.Three novel cyclolanostanol xylosides，cimicifugosides H-1，H-2 and H-5，from Cimicifuga Rhizome.Chem Pham Bull，1995，43:771-776.

Determination of Cimicifugoside H-1 in Rhizoma Cimicifugae by RP-HPLC

YAO Mei-fen1，2，WANG Yue-feng2，LI Zhan1，PAN Rui-le1，ZHAO Xiao-hong1，SI Jian-yong1*1Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China;2Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，China

To establish an RP-HPLC method for determination of cimicifugoside H-1 in Rhizoma Cimicifugae.H＆E XP ODS-A(4.6×250 mm，5 μm)column was employed with acetonitrile-water-phosphoric acid(35∶65∶0.4)as mobile phase，the flow rate was 1.0 mL/min.The column temperature was set 26℃ and detection wavelength was set at 203 nm.The linear range of cimicifugoside H-1 was 0.95～28.5 μg，the correlation coefficient was 0.9999 and the average recoveries(n=6)was 99.35%.The method is simple，rapid and reliable，which can be regarded as a reasonable method for determining the content of cimicifugoside H-1 in Rhizoma Cimicifugae.The results can be supported as data bases for developing quality specification of Rhizoma Cimicifugae.

Rhizoma Cimicifugae;cimicifugoside H-1;HPLC;quantitative determination

1001-6880(2011)04-0696-04

2009-08-14 接受日期:2009-11-03

國(guó)家藥典委員會(huì)項(xiàng)目－2010年版藥典增修訂(YZ-223)

*通訊作者 Tel:86-10-62899752;E-mial:jysi@implad.ac.cn

R284.1;R917

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