趙景輝，王再幸，趙偉剛，王英平，李榮峰，馮 卓，趙明忠，潘 揚(yáng)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林132109

高壓脈沖電場法快速提取北五味子中五味子醇甲的工藝研究

趙景輝*，王再幸，趙偉剛，王英平，李榮峰，馮 卓，趙明忠，潘 揚(yáng)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林132109

本文采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取方法，HPLC法測定五味子醇甲含量，對五味子的快速提取工藝方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:以80%乙醇作為提取液，電場強(qiáng)度10 kv/cm，脈沖數(shù)為10，料液比1∶10為最佳提取工藝;影響因素的大小依次為:電場強(qiáng)度、料液比、脈沖數(shù)。此法提取五味子中的五味子醇甲，提取率可達(dá)0.76%，得膏率達(dá)27.886%。本提取工藝可行，經(jīng)濟(jì)、省時、回收率高。

北五味子;五味子醇甲;提取工藝;正交實(shí)驗(yàn);高壓脈沖電場

五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz)Baill)的干燥果實(shí)。五味子性味酸甘，性溫，無毒。入肺、心、腎經(jīng)。主要分布于我國東北、朝鮮半島、日本及俄羅斯的遠(yuǎn)東地區(qū)，其果實(shí)為我國的常用名貴中藥材，具有益氣、滋腎、斂肺、固精、益脾、生津、安神等多種功效;主治肺虛咳嗽、津傷口渴、自汗盜汗、神經(jīng)衰弱、久瀉久痢、心悸失眠、多夢、遺精遺尿等癥。在傳統(tǒng)的中藥組方中五味子的利用頻次極高，如小青龍湯、清肺湯、人參養(yǎng)榮湯、生脈散、清熱補(bǔ)氣湯等皆有利用，近年來，利用五味子在乙肝等的治療方面開發(fā)出多種新藥，如聯(lián)苯雙酯、五酯膠囊、復(fù)方五仁醇膠囊、五酯片、肝得寧等，均獲得較好的療效。研究其快速提取技術(shù)具有較大實(shí)際意義。

五味子醇甲是五味子的主要活性成分之一，具有保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞、抗驚厥、保肝等藥理活性，因而備受關(guān)注。其提取方法有超聲、二氧化碳超臨界萃取、加熱回流等，成本高、費(fèi)時、費(fèi)力，耗能巨大。本試驗(yàn)以五味子醇甲和浸膏得率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化高頻電場提取工藝，具有快速、節(jié)能、低溫提取等特點(diǎn)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

五味子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所園藝特作研究室五味子課題組提供，為北五味子Schisandra chinensis(Turcz)Baill。

1.2 試藥

五味子醇甲對照品(中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號110857-200709)，甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

LDT-100/4-25.2型中藥高壓脈沖電場提取裝置(長春華迪生物科技開發(fā)有限公司);OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(日本東京理化株式會社);電子天平ALC-210.4(Sartorius group);DZKW-D恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(河北黃驊市航天儀器廠);101-3C型烘箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠);600 E高效液相色譜儀(美國Waters)。

2 方法

2.1 單因素試驗(yàn)

溶劑濃度選擇，本試驗(yàn)選擇了水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇等8種溶液為提取劑。以電場強(qiáng)度15 kv/cm，脈沖數(shù)8個，料液比1∶10為提取參數(shù)。稱取五味子干品，粉碎至100目，分別稱取100 g，加入不同濃度的提取液浸濕、混勻，用泵將樣液打入中藥高壓脈沖電場提取裝置中進(jìn)行提取，所得提取液過濾后減壓濃縮至100 mL，取2 mL用HPLC檢測五味子醇甲含量，其他真空干燥至恒重，計(jì)算浸膏得率。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 因素水平設(shè)計(jì)

由于是連續(xù)流動進(jìn)樣提取，不考慮提取溫度、提取時間和提取次數(shù)的影響;又因?yàn)榱魉倥c脈沖數(shù)成相關(guān)，所以影響提取的因素主要有:電場強(qiáng)度、脈沖數(shù)、料液比。采用L9(34)正交表優(yōu)化提取條件，重點(diǎn)考察上述三個因素，以五味子醇甲為考察指標(biāo)，見表1。

表1 L9(34)實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 L9(34)Experimental factor level table

2.2.2 樣品制備

分別稱取五味子干品各100 g，按L9(34)正交表所列實(shí)驗(yàn)因素和實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行試驗(yàn)，所得提取液過濾后減壓濃縮至100 mL，用HPLC檢測五味子醇甲含量，結(jié)果見表3。

2.2.3 含量測定

2.2.3.1 色譜條件［1］色譜柱:Agilent Hypersil ODS (4.6×200 mm，5μm);流動相:甲醇-水(65∶35);流速:1.0 mL/min;檢測波長:250 nm;進(jìn)樣量5 μL。

2.2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取五味子醇甲對照品3.2 mg，置10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻。再從中吸取0.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2.3.3 供試品溶液的制備五味子提取液2 mL，分別用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，再從中吸取3 mL至5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3.4 線性關(guān)系的考察分別精密吸取五味子醇甲對照品溶液3、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀檢測，記錄色譜圖及峰面積。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:y=2E+06x+7196(R2=0.9997)。結(jié)果表明五味子醇甲在0.0048～0.032 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.5 樣品的測定

分別精密吸取五味子不同濃度乙醇提取液各5 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各提取液中五味子醇甲的含量。結(jié)果見表2和表3。

3 結(jié)果

3.1 溶劑濃度對提取結(jié)果的影響

表2 乙醇濃度對提取的影響Table 2 Ethanol concentration on the extraction

從表2可以看出，經(jīng)比較可以看出以80%乙醇作為提取液，五味子醇甲和浸膏的得率都最高。因此確定80%乙醇溶液為最佳提取劑。

3.2 電場強(qiáng)度、脈沖數(shù)、料液比對提取結(jié)果的影響

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 L9(34)Experimental results and analysis of orthogonal

表4 五味子醇甲正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Experimental results and analysis of schizandrol orthogonal experments

經(jīng)過表3、表4的直觀分析、方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明:影響五味子醇甲提取的主次因素為A＞C＞B，即電場強(qiáng)度＞料液比＞脈沖數(shù)。最佳提取工藝為A1B2C1，即電場強(qiáng)度10 kv/cm，脈沖數(shù)為10，料液比1∶10。方差分析可知，電場強(qiáng)度、脈沖數(shù)和料液比對提取五味子醇甲無顯著影響。由于A1B2C1組合并不在上述的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)里，需另做一組正交試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

3.3 提取工藝試驗(yàn)驗(yàn)證

稱取三份五味子干品，各100 g，按A1B2C1組合進(jìn)行試驗(yàn)，所得提取液過濾后減壓濃縮至100 mL，取2 mL測五味子醇甲含量，其他真空干燥至恒重，計(jì)算浸膏得率。重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)，得五味子醇甲含量為0.76(%占生藥)，RSD=1.13%。

結(jié)果顯示:采用此方法提取，3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中五味子醇甲含量無明顯變化。

4 討論

中藥高壓電場常溫提取技術(shù)是利用分子在高壓電場條件下產(chǎn)生極化反應(yīng)原理，克服分子間的引力，在適合的溶劑條件下，達(dá)到快速溶出的目的.溶出過程是固液相混合后經(jīng)過電場提取器在流動狀態(tài)下瞬時完成，提取后進(jìn)行固液分離，溶出物留在液相中，然后進(jìn)行濃縮或其它工藝處理.

國外自20世紀(jì)初開始利用高壓電場對牛奶進(jìn)行滅菌，以后逐漸發(fā)展到對各種食品滅菌。進(jìn)入21世紀(jì)，我國科技工作者將此技術(shù)應(yīng)用于中藥提取，并取得一定進(jìn)展［2］。該技術(shù)用于五味子有效成分提取尚屬首次，具有提取速度快，溶劑與中藥原料經(jīng)過混合后在快速流動狀態(tài)下瞬間一次完成提取，沒有停滯、存留過程;常溫提取，對五味子活性成分及風(fēng)味無影響;處理均勻，在電場中各部分的物料均受到相同大小場強(qiáng)的處理(電極邊緣除外);能耗低，與傳統(tǒng)的熱提取方法比較節(jié)能50%以上;適應(yīng)性好，適用于能溶于水、醇等溶劑的各種中藥材的有效成分提取。但是，應(yīng)當(dāng)根據(jù)需求采取不同的工藝參數(shù)，若想得到大量提取物應(yīng)當(dāng)以電場強(qiáng)度15 kv/cm，脈沖數(shù)為10，料液比1∶12的參數(shù)進(jìn)行提取;如果以五味子醇甲為目標(biāo)物則以電場強(qiáng)度10 kv/cm，脈沖數(shù)為10，料液比1∶10為參數(shù)進(jìn)行提取。

該方法穩(wěn)定、可行、適用于工業(yè)化生產(chǎn)，可作為五味子的提取工藝。

1 Cheng M(程敏).HPLC method for determination of the content of schizandrol A in Schizandra which introducted to south.Shaanxi J Agric Sci(陜西農(nóng)業(yè)科學(xué))，2008，2:76-77.

2 Zeng XA(曾新安)，Chen Y(陳勇).Pulse Electric Unheated Sterilization Technology(脈沖電場非熱滅菌技術(shù)).Beijing:China Light Industry Press，2005.3-5.

Rapid Extracting Technology for Schisandrol A from Schisandra chinensis by High Voltage Pulsed Electric Field Method

ZHAO Jing-hui*，WANG Zai-xing，ZHAO Wei-gang，WANG Ying-ping，LI Rong-feng，F(xiàn)ENG Zuo，ZHAO Ming-zhong，PAN Yang
Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Jilin 132109，China

The rapid extracting technology for schisandrol A from Schisandra chinensis was investigated by using orthogonal experimental design，and the content of schisandrol A was detected by HPLC.The optimum extracting technology was obtained as follows:80%ethanol as for the extract liquid，10 kv/cm electric field intensity，impulsion frequency of 10，and 1∶10 as the ratio for material and liquid.The effect levels of these factors successively were electric field intensity，the ratio for material and liquid，and impulsion frequency.The content of schisandrol A was 0.76%in S.chinensis，and the yield of extract was 27.886%.The extracting technology is feasible，economic with high recovery ratio and saving time in the process.

Schisandra chinensis;schisandrol A;extracting technology;orthogonal experiment;high voltage pulsed electric field

1001-6880(2011)04-0755-03

2010-02-23 接受日期:2010-06-30

科技部科技支撐項(xiàng)目(2007GAI38B03，2006BAI06A14-03)

*通訊作者 Tel:86-432-66513409;E-mail:jinghuiz@126.com

R284.2

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