克林霉素對(duì)穿通支原體誘導(dǎo)小鼠膀胱移行細(xì)胞癌Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

任 帆 方周溪 曹淑彥 周麗萍 (溫州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，溫州325000)

穿通支原體(Mycoplasma penetrans，Mpe)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)與艾滋病相關(guān)的致病性支原體，即AIDS相關(guān)支原體之一[1]。1995年 Tsai等[2]報(bào)道穿通和發(fā)酵支原體感染小鼠胚胎細(xì)胞C3H，6周引起C3H細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，但不伴有惡性改變，而到第11周即出現(xiàn)惡性改變，18周之后轉(zhuǎn)化不可逆轉(zhuǎn)，并在裸鼠體內(nèi)形成瘤，提示穿通支原體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化是一個(gè)多階段多步驟的積累過(guò)程，由正常細(xì)胞發(fā)生可逆性轉(zhuǎn)化，繼之不可逆性惡性轉(zhuǎn)化，與人類腫瘤的發(fā)生過(guò)程相似。支原體及其脂蛋白可直接誘導(dǎo)凋亡，亦可通過(guò)局部細(xì)胞因子或其他物質(zhì)間接誘導(dǎo)抗凋亡[3，4]。Bcl-2/Bax 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡最為密切的一對(duì)凋亡相關(guān)基因，在細(xì)胞的凋亡-抗凋亡調(diào)控中起著重要作用。Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。組織細(xì)胞凋亡平衡失調(diào)，結(jié)果引發(fā)組織過(guò)度生長(zhǎng)，產(chǎn)生腫瘤[5]。1999年，F(xiàn)eng 等[4]報(bào)道支原體感染可抑制小鼠骨髓細(xì)胞32D凋亡，并誘導(dǎo)其惡性轉(zhuǎn)化。近年來(lái)進(jìn)一步證實(shí)支原體感染和腫瘤發(fā)生相關(guān)[6]。周麗萍等[7，8]從膀胱移行細(xì)胞癌、宮頸癌患者的血液和腫瘤組織中成功分離到穿通支原體。我們?cè)鴪?bào)道小鼠上行感染Mpe，制備膀胱移行上皮細(xì)胞癌模型，并且免疫缺陷組更為明顯[9]。Hayes等[10，11]分別于1993 年和 1995 年曾報(bào)道克林霉素對(duì)Mpe敏感。目前有關(guān)免疫缺陷患者協(xié)同Mpe感染的臨床治療未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究經(jīng)最小殺菌濃度 MBC 和最低抑制濃度 MIC 測(cè)定[10，11]，選用對(duì)Mpe敏感的抗生素克林霉素，制備Mpe誘導(dǎo)免疫缺陷小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞癌克林霉素干預(yù)模型，旨在探討克林霉素對(duì)Mpe誘導(dǎo)免疫缺陷小鼠膀胱移行細(xì)胞癌Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，并對(duì)致癌小鼠的膀胱組織進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。試圖為臨床穿通支原體潛在致癌的預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡清潔級(jí)健康ICR雌性小鼠50只，溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)株來(lái)源 標(biāo)準(zhǔn)菌株Mpe(ATCC55252)由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室趙季文教授惠贈(zèng)。

1.1.3 改良SP-4培養(yǎng)基以及菌液的制備 見(jiàn)文獻(xiàn)[7，8]。

1.1.4 藥物 環(huán)磷酰胺(0.2 g/瓶):江蘇恒瑞醫(yī)藥股份公司(批號(hào)09012421);克林霉素(0.6 g/瓶):重慶萊美藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)090201);一抗為兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體(1∶200)(Bioworld Technology公司);二抗為山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.1.5 儀器 RMC-PT超薄切片機(jī);H-7500透射電鏡;顯微熒光照相系統(tǒng)(Nikon E-800);Olympus顯微鏡CX21。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 50只ICR雌性小鼠(16～20 g/只)采用環(huán)磷酰胺免疫抑制[9]后，隨機(jī)分為3組:①克林霉素干預(yù)組，20只，經(jīng)泌尿道上行感染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Mpe(6×108-9ml-1)0.1 ml，連續(xù)3天，上行感染同時(shí)肌肉注射克林霉素(25 mg/kg·d)，連續(xù)保護(hù) 4天。②Mpe非干預(yù)組，20只，用 Mpe 0.1 ml經(jīng)泌尿道上行感染，連續(xù)3天;③生理鹽水對(duì)照組，10只，無(wú)菌生理鹽水0.1 ml經(jīng)泌尿道上行，連續(xù)3天。以上各組在感染后的8、18周分批宰殺，心臟無(wú)菌穿刺取血后取部分膀胱組織。

1.3 檢查方法

1.3.1 血清Mpe再培養(yǎng) 將8周的各組小鼠血清接種SP-4液體培養(yǎng)基，置5%CO237℃ 4～5天，發(fā)現(xiàn)液體變黃，澄清，過(guò)濾除菌，分別稀釋100倍后取0.1 ml轉(zhuǎn)種于支原體固體培養(yǎng)基，置5%CO237℃ 4～5天，置低倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)油煎蛋樣菌落，并與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照。

1.3.2 光鏡標(biāo)本的制作與觀察 分別取感染后8和18周Mpe非干預(yù)組的小鼠膀胱組織，1 cm×1 cm×1 cm，經(jīng)福爾馬林常規(guī)固定，石蠟包埋，分別用HE、甲基胺藍(lán)染色，觀察膀胱內(nèi)皮移行細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 電鏡標(biāo)本的制作與觀察 分別取18周后各組小鼠的膀胱組織，0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm，置入電鏡固定液，經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，丙酮酸梯度脫水，Epon-812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，RMC-PT超薄切片機(jī)切片，半薄切片電鏡定位于膀胱移行細(xì)胞部分，超薄切片經(jīng)鉛-鈾雙重染色，H-7500透射電鏡下觀察，拍片。

1.3.4 免疫組化的檢測(cè)與觀察 分別取感染18周后各組小鼠的膀胱組織，1 cm×1 cm×1 cm，經(jīng)4%多聚甲醛固定過(guò)夜后，按常規(guī)方法制成蠟塊，連續(xù)切片，片厚5 μm，每隔20張取蠟帶貼于載玻片上，采用SP法進(jìn)行常規(guī)的免疫組化染色，一抗為兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(1∶200)，兔抗鼠Bax多克隆抗體(1∶200)，二抗為山羊抗兔IgG，石蠟切片脫蠟至水，免疫組化檢測(cè)采用高壓抗原修復(fù)及SP法，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色劑室溫下顯色，蘇木素復(fù)染，陰性對(duì)照用PBS替代一抗，其余步驟同上。結(jié)果判斷[12]:Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色(2人雙盲法觀察)，選取至少5個(gè)代表性高倍視野，不少于200個(gè)細(xì)胞，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估[12]。以膀胱移行上皮細(xì)胞胞漿顯棕黃色為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)采用高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，以百分率表示。根據(jù)細(xì)胞染色程度、范圍和分布不同進(jìn)行判斷[12]，陰性(-):陽(yáng)性細(xì)胞 ＜25%;輕度陽(yáng)性(+):陽(yáng)性細(xì)胞26% ～50%;中度陽(yáng)性(++):陽(yáng)性細(xì)胞51% ～75%;強(qiáng)陽(yáng)性(+++):陽(yáng)性細(xì)胞＞76%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 18周后各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性率計(jì)數(shù)，取+以上作為陽(yáng)性例數(shù)，采用Fisher確切概率法做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間P＜0.05，提示組間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察 克林霉素干預(yù)、非干預(yù)組與生理鹽水對(duì)照組比較，小鼠膀胱無(wú)明顯區(qū)別。

2.2 血清Mpe再培養(yǎng) 8周的克林霉素干預(yù)組與非干預(yù)組小鼠的血清Mpe再培養(yǎng)均為陽(yáng)性，但克林霉素干預(yù)組Mpe菌落檢出較非干預(yù)組明顯減少，NS對(duì)照組為陰性。

2.3 光鏡觀察 非干預(yù)組小鼠8周后膀胱組織切片，可見(jiàn)細(xì)胞大小均一，排列整齊，細(xì)胞核正常(圖1A);而18周后小鼠的膀胱組織切片，移行細(xì)胞出現(xiàn)癌變，細(xì)胞排列紊亂，大小不一，細(xì)胞核增大(圖1B)。

2.4 電鏡觀察 NS對(duì)照組的小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞，胞質(zhì)致密，細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核仁小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊密排列(圖2A)。非干預(yù)組小鼠18周后膀胱移行上皮細(xì)胞核間隙大，核型不規(guī)則，核仁明顯，多核仁，且有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，膠原纖維水腫疏松(圖2B)，提示穿通支原體感染能誘導(dǎo)小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞發(fā)生癌變。而克林霉素干預(yù)組小鼠18周后膀胱上皮細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞腫脹，線粒體腫脹不明顯(圖2C)，克林霉素干預(yù)組無(wú)癌變，提示克林霉素對(duì)穿通支原體誘導(dǎo)的小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞癌具有干預(yù)作用。

圖1 光鏡檢查(苯甲胺藍(lán)染色，×400)Fig.1 Histological section(Stained by Toluidine Blue，×400)

圖2 電鏡檢查(×4 000)Fig.2 Electron microscopy(×4 000)

表1 各組小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較結(jié)果Tab．1 The results of the expression of protein Bcl-2，Bax of mice bladder transitional cell in each experimental groups

圖3 免疫組化檢查Fig.3 Immunohistochemical examination

2.5 免疫組化觀察 免疫組化SP法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn):克林霉素干預(yù)組和生理組Bcl-2蛋白表達(dá)均低于非干預(yù)對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，克林霉素干預(yù)組與生理組間差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)，各組間Bax蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)，各組凋亡蛋白表達(dá)比較見(jiàn)表1，各檢測(cè)指標(biāo)蛋白表達(dá)見(jiàn)圖3。

3 討論

穿通支原體因穿入細(xì)胞感染而命名[9]。近年來(lái)的研究已證實(shí)Mpe感染動(dòng)物細(xì)胞后不但能引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、染色體畸變，并在裸鼠體內(nèi)形成瘤，提示Mpe存在致癌潛能。Mpe不但能阻止細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胚胎細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mpe感染免疫缺陷小鼠8周血清支原體菌落檢出率，克林霉素干預(yù)組較非干預(yù)組顯著降低。光鏡和電鏡下顯示Mpe感染8周時(shí)未見(jiàn)細(xì)胞異常，而隨之感染18周時(shí)光鏡和電鏡下發(fā)現(xiàn)非干預(yù)組小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞出現(xiàn)分裂、多核仁等轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，以及癌變細(xì)胞浸潤(rùn)，而克林霉素干預(yù)組小鼠18周時(shí)膀胱超微結(jié)構(gòu)觀察未見(jiàn)多核仁、核增大等腫瘤細(xì)胞指標(biāo)現(xiàn)象。

Bcl-2是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因之一。該基因通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存，參與腫瘤的發(fā)生[12]。大量研究表明Bcl-2在多種上皮性腫瘤，如胃癌、乳腺癌、前列腺癌等中均有異常表達(dá)[5]。Bax蛋白具有對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用[11]。Bax與Bcl-2基因序列有20.8%的同源性，其自身或與Bcl-2形成同源或異源二聚體分子發(fā)揮生物功能，研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax蛋白之間比例是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，當(dāng)Bcl-2過(guò)量表達(dá)，凋亡被抑制[12]。組織細(xì)胞凋亡平衡失調(diào)結(jié)果引發(fā)組織過(guò)度生長(zhǎng)，產(chǎn)生腫瘤[5]。有實(shí)驗(yàn)提示Bcl-2/Bax比值與細(xì)胞凋亡有較好的相關(guān)性，Bcl-2/Bax比值較小時(shí)(＜1)，凋亡指數(shù)較高，Bcl-2/Bax比值較大時(shí)(＞1)，凋亡指數(shù)降低[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，克林霉素干預(yù)組較非干預(yù)組小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞癌凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低。有研究提示Bcl-2為凋亡抑制因子，高 Bcl-2的表達(dá)與細(xì)胞凋亡指數(shù)成反比[12，13]。本研究采用免疫組化染色證實(shí)克林霉素能降低Bcl-2蛋白的表達(dá)，此結(jié)果與電鏡下觀察結(jié)果相吻合，此結(jié)果提示克林霉素對(duì)穿通支原體誘導(dǎo)小鼠膀胱移行上皮細(xì)胞癌具有一定干預(yù)作用。此研究為免疫缺陷患者協(xié)同AIDS相關(guān)支原體感染促使腫瘤發(fā)生的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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