小鼠核結(jié)合因子a1基因啟動(dòng)子報(bào)告載體的構(gòu)建及鑒定*

鄭 紡 崔 壯 王寶利 王洪武

核結(jié)合因子a1（core binding factor a1，Cbfa1）是成骨特異性轉(zhuǎn)錄激活因子，在成骨細(xì)胞發(fā)育、分化和骨形成過程中起著至關(guān)重要的分子開關(guān)作用。鑒于Cbfa1在骨形成過程中的關(guān)鍵作用，因此構(gòu)建Cbfa1基因啟動(dòng)子報(bào)告載體，通過觀察藥物對(duì)該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，可以用于促骨形成藥物的篩查及評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3E1、大腸桿菌菌種DH5α為本室保存。質(zhì)粒表達(dá)載體PGL3-Basic、螢光素酶活性測(cè)定試劑盒（Luciferase assay system）、β-半乳糖苷酶活性測(cè)定試劑盒（β-galactosidase assay kit）和MluI、XhoI限制性內(nèi)切酶均為Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA提取試劑盒均購自索萊寶公司；Lipofectamine2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶均購自GIBCO公司；dNTPs、KOD-plus ver2高保真DNA聚合酶為日本TOYOBO公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶、DNA Marker為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。引物序列及DNA序列分析由上海英駿生物技術(shù)公司合成及測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增小鼠Cbfa1基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列 取正常Balb/c小鼠尾靜脈血5 mL，按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取基因組DNA。分析小鼠Cbfa1基因的DNA序列，巢式PCR擴(kuò)增Cbfa1啟動(dòng)子區(qū)-1 000 bp～+200 bp區(qū)域的片段。巢式PCR第1輪引物為Cbfa1-out-up：5′-TGCAGAAC TGCACCCAAAGTCCT-3 ′；Cbfa1-out-down：5′-GGCTGTTTG ACGCCATAGTCCCT-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 560 bp。接著以第1輪PCR凝膠純化回收后產(chǎn)物為模板，以Cbfa1-in-XhoI-up：5′-AAAACTCGAGTTAAGATCTTCAAAGTAACCA-3 ′ 和Cbfa1-in-MluI-down：5′-AAAAACGCGTCGGAGTGAGCAAA TATTTGAAGGACCTACTA-3′為引物進(jìn)行第2輪PCR，擴(kuò)增Cbfa1啟動(dòng)子-1 000 bp～+200 bp區(qū)域并引入XhoI和MluI酶切位點(diǎn)，凝膠純化回收第2輪PCR產(chǎn)物。兩輪PCR反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。

1.2.2 小鼠Cbfa1基因啟動(dòng)子報(bào)告載體的構(gòu)建 XhoI和MluI雙酶切PCR擴(kuò)增并純化回收的長(zhǎng)約1 200 bpCbfa1啟動(dòng)子DNA片段，同時(shí)將螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic行XhoI和MluI雙酶切，回收線性化載體。T4連接酶將兩者定向連接。XhoI和MluI雙酶切并測(cè)序鑒定陽性克隆，正確插入的克隆命名為pGL3-Cbfa1報(bào)告基因載體。

1.2.3 MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染與報(bào)告基因分析 使用含10%FBS、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基將MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用消化液處理細(xì)胞，換用含10%FBS無抗生素的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，按2×105/孔接種至24孔板并隨機(jī)分為pGL3-Cbfa1轉(zhuǎn)染組和pGL3-Basic轉(zhuǎn)染組，使用lipofectamineTM2000分別將1 μg的重組質(zhì)粒pGL3-Cbfa1和對(duì)照載體pGL3-Basic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至各組MC3T3-E1細(xì)胞內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔均同時(shí)轉(zhuǎn)染0.1 μg β-半乳糖苷酶質(zhì)粒作為內(nèi)參照以校正細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（0.1 mol/L KH2PO4，1 mmol/L二硫蘇糖醇，pH=7.8），液氮凍融3次，4 ℃12 000 r/min離心20 min，收集上清。使用Luciferase assay system測(cè)定細(xì)胞的螢光素酶活性。相對(duì)熒光強(qiáng)度單位由β-galactosidase assay kit測(cè)定β-半乳糖苷酶活性做標(biāo)準(zhǔn)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組細(xì)胞同時(shí)檢測(cè)，每組細(xì)胞重復(fù)檢測(cè)3次，取平均值作為該組細(xì)胞的螢光素酶活性或β半乳糖苷酶活性值。以細(xì)胞螢光素酶活性/β-半乳糖苷酶活性比值表示啟動(dòng)子螢光素酶的相對(duì)活性。pGL3-Cbfa1報(bào)告載體的活性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠Cbfa1基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增 巢式PCR第1輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 560 bp，巢式PCR第2輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 220 bp。見圖1。

2.2 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報(bào)告基因載體的酶切鑒定和DNA序列分析 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報(bào)告基因載體經(jīng)MluI和XhoI雙酶切鑒定，得到4 800 bp和1 200 bp兩條片段；pGL3-Basic經(jīng)MluI和XhoI雙酶切鑒定得到約4 800 bp的線性片段。經(jīng)序列測(cè)定分析，重組報(bào)告載體中插入序列完全正確，載體序列與Cbfa1基因啟動(dòng)子序列正確拼接，見圖2。

2.3 pGL3-Cbfa1重組螢光素酶報(bào)告載體的活性檢測(cè) 重組報(bào)告載體pGL3-Cbfa1螢光素酶活性明顯升高（t=19.795，P<0.001），約為pGL3-Basic的35倍，見圖3。

3 討論

骨質(zhì)疏松的發(fā)生主要是由于成骨細(xì)胞的作用弱于破骨細(xì)胞的作用引起的，因此要想從根本上達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)骨形成就顯得更為重要。然而目前用于臨床的藥物基本上只能抑制骨丟失，不能促進(jìn)骨形成，只能在一定程度上延緩疾病的進(jìn)展，卻不能逆轉(zhuǎn)業(yè)已出現(xiàn)的骨量減少和骨顯微結(jié)構(gòu)的破壞，也就無法治愈骨質(zhì)疏松。因此要想從根本上治療骨質(zhì)疏松，尋找能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)骨形成的藥物至關(guān)重要。

Cbfa1是對(duì)成骨細(xì)胞分化、成熟起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞譜系高表達(dá)Cbfa1，該基因能促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)骨鈣素、堿性磷酸酶、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等下游成骨細(xì)胞表征分子，誘導(dǎo)多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型分化，促進(jìn)骨小結(jié)形成[1-3]。Cbfa1基因敲除的雜合子小鼠出生時(shí)骨組織發(fā)育明顯受阻，而純合子小鼠出生時(shí)無成骨細(xì)胞和骨組織形成[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等局部因子可上調(diào)Cbfa1表達(dá)[5-6]。因此，包括BMP在內(nèi)的許多局部因子與轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1的相互作用在成骨細(xì)胞發(fā)育和骨形成過程中起著十分重要的作用。基于Cbfa1在骨形成過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，筆者認(rèn)為它可以作為分子靶點(diǎn)用于抗骨質(zhì)疏松藥物的篩選。

為此，本研究進(jìn)行了Cbfa1啟動(dòng)子重組報(bào)告基因載體的構(gòu)建，并檢測(cè)了該報(bào)告載體的轉(zhuǎn)錄活性。用于構(gòu)建報(bào)告載體的小鼠Cbfa1基因啟動(dòng)子序列來自基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，考慮到如果直接擴(kuò)增這段長(zhǎng)約1 200 bp的區(qū)域，若恰好在啟動(dòng)子序列的關(guān)鍵元件發(fā)生堿基錯(cuò)配，會(huì)大大降低所構(gòu)建載體的可信度。另外，直接將該片段與螢光素酶報(bào)告載體進(jìn)行連接也不容易操作。因此，筆者采取了巢式PCR策略，通過兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的Cbfa1基因啟動(dòng)子DNA片段。文中第2對(duì)引物的功能是特異擴(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片段，并分別在兩條引物中引入能夠?qū)bfa1啟動(dòng)子定向克隆入螢光素酶報(bào)告載體pGL3-Basic的MluI和XhoI酶切位點(diǎn)。DNA序列分析結(jié)果證實(shí)整段序列全長(zhǎng)無錯(cuò)配堿基，且拼接的位置和方向正確。接下來，筆者將Cbfa1基因啟動(dòng)子片段插入不含啟動(dòng)子的pGL3-Basic載體的多克隆位點(diǎn)，獲得了重組報(bào)告基因載體pGL3-Cbfa1。該載體中Cbfa1啟動(dòng)子序列中含有許多重要的順式作用元件[7]，將它瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可通過檢測(cè)螢光素酶的表達(dá)水平來了解Cbfa1基因的基礎(chǔ)表達(dá)和藥物對(duì)Cbfa1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響。研究中，經(jīng)轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1，報(bào)告基因分析研究發(fā)現(xiàn)pGL3-Cbfa1報(bào)告載體與對(duì)照載體相比顯示出較高的活性，約為pGL3-Basic的35倍，該結(jié)果表明所構(gòu)建的報(bào)告載體能夠反映Cbfa1啟動(dòng)子的活性。本文中pGL3-Cbfa1報(bào)告載體的成功構(gòu)建為借助于Cbfa1啟動(dòng)子進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松藥物篩選提供了一個(gè)非常好的研究工具，也為進(jìn)一步建立抗骨質(zhì)疏松藥物的效果評(píng)價(jià)方法奠定了基礎(chǔ)。

[1]Jonason JH,Xiao G,Zhang M,et al.Post-translational regulation of runx2 in bone and cartilage[J].J Dent Res,2009,88(8):693-703.

[2]Igarashi M,Kamiya N,Hasegawa M,et al.Inductive effects of dexamethasone on the gene expression of Cbfa1,Osterix and bone matrix proteins during differentiation of cultured primary rat osteoblasts[J].J Mol Histol,2004,35(1):3-10.

[3]Ziros PG,Gil AP,Georgakopoulos T,et al.The bone-specific transcriptional regulator Cbfa1 is a target of mechanical signals in osteoblastic cells[J].J Biol Chem,2002,277(26):23934-23941.

[4]Komori T,Yagi H,Nomura S,et al.Targeted disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts[J].Cell,1997,89(5)：755-764.

[5]Jun JH,Yoon WJ,Seo SB,et al.BMP2-activated Erk/MAP kinase stabilizes Runx2 by increasing p300 levels and histone acetyltransferase activity[J].J Biol Chem,2010,285(47):36410-36419.

[6]Chen NX,Duan D,O’Neill KD,et al.High glucose increases the expression of Cbfa1 and BMP-2 and enhances the calcification of vascular smooth muscle cells[J].Nephrol Dial Transplant,2006,21(12):3435-3442.

[7]Xiao ZS,Liu SG,Hinson TK,et al.Characterization of the upstream mouse Cbfa1/Runx2 promoter[J].J Cell Biochem,2001,82(4):647-659.