吳金平， 鄭芳圓

（1．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，武漢 430064； 2．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院，武漢 430070）

草莓（Fr agaria ananassa）屬漿果類果樹(shù)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值。近年來(lái)，隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，草莓種植業(yè)迅速發(fā)展，草莓病害也越來(lái)越嚴(yán)重，其中最嚴(yán)重的是炭疽病、白粉病和灰霉病這三大病害。但筆者通過(guò)對(duì)湖北省宜都、沙市等草莓育苗基地調(diào)查，發(fā)現(xiàn)草莓在新葉時(shí)期、或葉片濕度大，或整株淹沒(méi)灌溉和潮濕多雨期，草莓褐色輪斑 病 （Pho mopsis leaf blight）［1］感 病 田 發(fā) 病 率 一般為10%～30%，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)80%～100%；且其侵染葉柄和匍匐莖時(shí)，產(chǎn)生紫黑色病斑，橢圓形稍凹陷［2］。草莓褐色輪斑病的發(fā)生和危害，極大地影響了草莓的種苗質(zhì)量。筆者通過(guò)對(duì)該病菌的形態(tài)、生物學(xué)特性和病菌的ITS序列分析，確定其種屬地位，并篩選了一些有效藥劑，為其防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 供試菌株

用組織分離法［3］從湖北省宜都、沙市等草莓基地草莓葉片、匍匐莖上分離、純化、保存病菌。

1．2 病原菌形態(tài)觀察和離體回接鑒定

將病菌菌塊先置于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（potato－sugar－agar，PSA）［3］平板中央，28 ℃、黑暗培養(yǎng)3 d后，觀察菌落顏色和形態(tài)；并用無(wú)菌水洗下培養(yǎng)菌落中的分生孢子，在顯微鏡（XDS－500倒置顯微鏡）下觀察其形態(tài)。

選取健康的草莓葉片，用自來(lái)水沖洗干凈后，用75%乙醇棉球輕擦表面，用保鮮膜包裹葉柄。在無(wú)菌操作臺(tái)上用鑷子輕刮葉片表面，使其形成微創(chuàng)傷，然后用無(wú)菌打孔器打取5 mm菌餅放在創(chuàng)傷處。以不接病菌的草莓葉片為對(duì)照。整個(gè)瓷盤(pán)底部放置滅菌的報(bào)紙，并用無(wú)菌水打濕，將處理好的葉片放在瓷盤(pán)中，用保鮮膜包裹瓷盤(pán)。3次重復(fù)，每天觀察并記錄是否發(fā)病。

1．3 菌絲生長(zhǎng)的最適溫度和pH

將直徑為5 mm的菌苔移到PSA平板中央，分別置5、10、15、20、25、28、30、35℃的恒溫條件下培養(yǎng)，3 d后測(cè)量菌落直徑。設(shè)pH4～11共9個(gè)梯度，接菌塊于PSA平板中央。平板置于28℃條件下培養(yǎng)3 d，然后測(cè)量菌落直徑。3次重復(fù)。

1．4 營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用査彼（Czapek）培養(yǎng)基：硝酸鈉2 g、氯化鉀0．5 g、硫酸亞鐵0．01 g、磷酸氫二鉀1．0 g、硫酸鎂0．5 g、蔗糖30 g、瓊脂17 g。碳源用葡萄糖、D－果糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖和可溶性淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源；氮源用甘氨酸、酵母浸出液、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、磷酸二氫銨、硝酸銨和L－谷氨酸鈉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源。28℃條件下接菌培養(yǎng)3 d后測(cè)量菌落直徑。3次重復(fù)。

1．5 核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的PCR擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將病原菌菌塊移至PSA平板上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)48～72 h，然后將菌落邊緣的菌絲切成2～3 mm的菌落小塊，把4～5塊菌絲塊移至PSA液體培養(yǎng)基，28℃、120 r／min振蕩培養(yǎng)3～4 d。將液體培養(yǎng)好的病菌菌絲，在雙層尼龍網(wǎng)上過(guò)濾，用水洗滌2次，以除去菌絲內(nèi)的培養(yǎng)液，收集菌絲，將其包好放在硅膠中過(guò)夜，吸干水分，用液氮研磨成粉末，參照劉少華等［4］報(bào)道的尿素法提取病菌菌絲DNA。病原菌r DNA的ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增選用的引物分別為ITS1和ITS4，其堿基序列如下［5］：ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′），ITS4 （5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。PCR 反應(yīng)體系：10 mmol／L的三磷酸堿基脫氧核苷酸2μL，20 mmol／L的氯化鎂2μL，緩沖液2．5μL，加10μmol／L的引物ITS1和ITS4各0．5μL，2 U／μL的Taq酶1μL，模板0．5μL，使用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測(cè)到600 bp左右的條帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收，回收片段與克隆載體p GEM－T連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH－5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，部分菌液用M13（F／R：GTAAAACGACGGCCAG／CAGGAAACAGCTATGAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，并將檢測(cè)后確認(rèn)含有目的片段的陽(yáng)性克隆送到華大基因測(cè)序公司測(cè)序。

將測(cè)得的基因序列在Gen Bank（http：∥www．ncbi．nl m．nih．gov／）中進(jìn)行blast比較，ITS序列同源性較高的登記菌株作為參比菌株。用CLUSTALX 1．8軟件對(duì)相似的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，由MEGA 4．0軟件采用鄰接法（neighbor－joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建和聚類分析，確定菌株在微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的地位。

1．6 藥劑抑菌試驗(yàn)

供試藥劑：80%代森錳鋅可濕性粉劑（利民化工有限責(zé)任公司）；80%炭疽福美可濕性粉劑（成都雙益化工有限公司）；50%甲基硫菌靈可濕性粉劑（陜西蒲城縣美邦農(nóng)藥有限責(zé)任公司）；70%錳鋅·百菌清可濕性粉劑（利民化工有限責(zé)任公司）；64%惡霜·錳鋅可濕性粉劑（先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司）；72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑（成都市金堂福田農(nóng)藥有限公司）；90%鏈土霉素可濕性粉劑（山東恒利達(dá)化學(xué)品公司）；12%松脂酸銅水乳劑（北京中農(nóng)博雅科技發(fā)展有限公司）；50%咪鮮胺乳油（江門(mén)市大光明農(nóng)化有限公司）。各藥劑濃度根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)的建議調(diào)節(jié)：代森錳鋅、甲基硫菌靈和松脂酸銅稀釋1 500倍；錳鋅·百菌清、惡霜·錳鋅、甲霜·錳鋅、鏈土霉素和咪鮮胺稀釋1 000倍；炭疽福美稀釋500倍作為標(biāo)準(zhǔn)濃度。

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［6］測(cè)定藥劑的抑菌作用，并設(shè)清水對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌帶寬度。每處理重復(fù)4次。

凈生長(zhǎng)量＝菌落直徑－菌餅直徑，抑菌帶寬度＝CK凈生長(zhǎng)量－處理凈生長(zhǎng)量。

2 結(jié)果和分析

2．1 病原菌形態(tài)和回接鑒定

病原菌在PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，菌落近圓形，乳白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)（圖1a）。28℃下培養(yǎng)3 d后在顯微鏡下觀察分生孢子。α型分生孢子，單胞，（5．5～7．0）μm×（2．0～3．5）μm（圖1b）。病菌接種后第2天，葉片出現(xiàn)病斑，隨后病斑逐漸擴(kuò)大；第5天，葉片出現(xiàn)典型的病癥，病斑近圓形或不規(guī)則形，褐色，上有輪紋。

圖1 草莓褐色輪斑病病原菌培養(yǎng)形態(tài)

2．2 菌絲生長(zhǎng)的最適溫度和p H

圖2表明，菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度范圍是25～30℃，最適溫度為25～28℃，在25～28℃之間菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，3 d后菌落直徑達(dá)到7．18 c m。圖4表明，菌絲生長(zhǎng)的適宜p H范圍是4～6，最適p H為6，在p H 2和p H 9過(guò)酸過(guò)堿條件下菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

2．3 營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

從圖4可以看出，病菌對(duì)碳源的利用率高低為蔗糖＞可溶性淀粉＞麥芽糖＞乳糖＞甘露醇＞果糖＞葡萄糖，其中麥芽糖和乳糖作為碳源菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。從圖5可以看出，病菌對(duì)氮源的利用率高低為酵母浸出液＞蛋白胨＞硝酸銨＞硝酸鉀＞磷酸二氫銨＞硫酸銨＞甘氨酸＞硝酸鈉＞L－谷氨酸鈉，其中甘氨酸和硫酸銨、硝酸鈉和L－谷氨酸鈉菌落生長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

2．4 核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS的PCR序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)比較分析

把所得的病菌序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank 中 的 序 列 號(hào)：HM 854852．1，HM 854851．1，H M 854850．1），利用Blast工具與Gen－Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知微生物的ITS序列進(jìn)行同源性比對(duì)。從圖6可看出，分離獲得的3個(gè)菌株與Sphaeronaemella f ragariae和Phomopsis obscurans聚為一群，但和Sphaeronaemell a f r agariae的遺傳圖距近一些。

圖6 草莓褐色輪斑病菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2．5 不同殺菌劑的室內(nèi)抑菌作用

代森錳鋅、錳鋅·百菌清、惡霜·錳鋅這3種農(nóng)藥對(duì)褐色輪斑病沒(méi)有任何防效。在標(biāo)準(zhǔn)濃度條件下，筆者對(duì)幾種有效藥劑進(jìn)行了方差分析，從表1結(jié)果可以看出整體防效：咪鮮胺＞松脂酸銅＞甲基硫菌靈＞鏈土霉素＞甲霜靈·錳鋅＞炭疽福美。

表1 不同殺菌劑對(duì)草莓褐色輪斑病的室內(nèi)抑菌作用1）

3 小結(jié)與討論

目前，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)用ITS序列研究草莓褐色輪斑病病原的報(bào)道。一般都是通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，如Halstead于1893年鑒定為Aposphaeria屬［7］；1895年，Ellis及 Ever hart將其病原確定為Phoma obscur ans［8］；1920年，Anderson重新命名病原為Dendrophoma obscurans［9］；1972年，Howard等再次確認(rèn)該病原菌為 D．obscurans［10］；2000年，我國(guó)陸家云確定其病原菌為半知菌類、腔孢綱、球殼孢目、球殼孢科、擬莖點(diǎn)霉屬的暗擬莖點(diǎn)霉Phomopsis（Dendr ophoma）obscur ans （Ell et EV．）［11］；2005年，賈曉輝通過(guò)生物學(xué)特性鑒定沈陽(yáng)地區(qū)草莓褐色輪斑病的病原為Phomopsis obscur ans（Ell et EV．）［6］。由于病菌的形態(tài)受培養(yǎng)環(huán)境等因素影響，本研究在結(jié)合形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，首次對(duì)該病原菌的ITS進(jìn)行研究，并將其上傳Gen－Bank與其他菌聚類分析，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出本研究分離獲得的病菌序列與Sphaeronaemell a f r agariae和Phomopsis obscur ans序列屬于同一分支。而2000年Ellis［12］等在研究由Phomopsis引起的草莓腐爛病時(shí)，在觀察分生孢子形態(tài)過(guò)程中，提出了P．obscur ans與S．f r agariae可能是同一病菌的質(zhì)疑，2004年 Hausner［13］等利用小亞基核糖體RNA（the nuclear s mall subunit riboso mal RNA）從分子角度論證了P．obscur ans與S．f r agaria e是同一病菌。而本研究通過(guò)病菌的ITS序列構(gòu)建的的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，獲得的草莓褐色輪斑病病菌為S．f r agariae，此結(jié)果與Hausner等的研究結(jié)果一致。

經(jīng)生物學(xué)特性研究表明，該病菌菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25～28℃，最適p H是6，最適碳源是蔗糖，最適氮源是酵母浸出液。因此，在不影響草莓生長(zhǎng)的情況下，通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)環(huán)境的溫、濕度或者p H，對(duì)病情可能起到一定的控制作用。

通過(guò)室內(nèi)藥劑試驗(yàn)證明，松脂酸銅和咪鮮胺對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而在露地及溫室內(nèi)實(shí)際生產(chǎn)中，這兩種藥劑是否是最有效藥劑，還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

［1］ Michael A E，Mizuho N．Pho mopsis leaf blight and fr uit rot of strawberr y［EB／OL］．Ohio State University Extension Fact Sheet HYG－3211－02，2003．http：∥ohioline．osu．edu／hygfact／3000／3211．ht ml．

［2］ 相建業(yè)，張管曲，謝芳芹，等．草莓病蟲(chóng)害識(shí)別與無(wú)公害防治［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007．

［3］ 方中達(dá)．植物病理研究方法［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1979．

［4］ 劉少華，陸金萍，朱瑞良，等．一種快速簡(jiǎn)便的植物病原真菌基因組DNA 提取方法［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（4）：362－365．

［5］ 任小杰，梁艷，陸金萍，等．上海地區(qū)草莓炭疽病病原鑒定［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2008，38（3）：325－328．

［6］ 賈曉輝，傅俊范，周如軍，等．草莓褐色輪斑病病原生物學(xué)研究及防治藥劑的篩選［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33（10）：1849－1850．

［7］ Halstesd B D．Disease of t he strawberr y［J］．N J Agr Exp Sta Rep，1893，14：327－332．

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［13］Geor g Hausner，Ja mes Reid．The nuclear s mall subunit ribosomal genes of Sphaer onaemell a hel vell ae，Sphaeronaemell a f i micol a，Gabar naudia betae，and Cor nuvesica f alcata：phylogenetic i mplications［J］．Can J Bot，2004，82：752－762．