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      pH-stat控制流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母產(chǎn)蝦青素

      2011-12-05 09:15:02朱曉立梁世中鄧毛程朱明軍
      食品研究與開發(fā) 2011年4期
      關(guān)鍵詞:青素碳源酵母

      朱曉立,梁世中,鄧毛程,朱明軍

      (1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,廣東 廣州 510300;2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)

      pH-stat控制流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母產(chǎn)蝦青素

      朱曉立1,梁世中2,鄧毛程1,朱明軍2

      (1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,廣東 廣州 510300;2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640)

      通過酸堿流加培養(yǎng)、混合碳源-氨水流加培養(yǎng)、混合碳源-尿素流加培養(yǎng)等pH-stat控制流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母產(chǎn)蝦青素。pH-stat控制流加培養(yǎng)與分批培養(yǎng)相比較,生物量及蝦青素產(chǎn)量都有不同程度地提高。從提高蝦青素產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本綜合考慮,混合碳源-氨水流加培養(yǎng)是最理想的方法,培養(yǎng)96 h蝦青素產(chǎn)量最高達(dá)到19.94 mg/L。

      紅發(fā)夫酵母;蝦青素;pH-stat;流加培養(yǎng)

      色素與食品的關(guān)系密不可分,色素賦予食品誘人的色澤,從而給消費(fèi)者帶來良好的感官質(zhì)量和強(qiáng)烈的購買欲。食用色素按來源可分為天然和人造色素兩大類。近年來發(fā)現(xiàn)人工化學(xué)合成色素有的存在致癌和致突變作用,故天然色素日益受到人們重視,而開發(fā)具有一定營養(yǎng)價值或藥理作用的功能性天然色素,是色素工業(yè)發(fā)展的重中之重。

      蝦青素是一種廣泛存在于生物體的紅色素,盡管“蝦青素”一詞在日常生活中不常使用,但蝦青素存在于許多種人類食物之中。大多甲殼類動物如蝦、龍蝦、螃蟹等呈現(xiàn)的紅色均因蝦青素積累所致,一些魚肉如鮭魚的肉色也是蝦青素積累的結(jié)果。在實(shí)際生產(chǎn)中,蝦青素常用作魚蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的飼料添加劑,以便彌補(bǔ)人類膳食中蝦青素的缺乏,同時改善水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品的質(zhì)量[1-2]。動物實(shí)驗(yàn)表明蝦青素有抑制腫瘤發(fā)生[3]、增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老[4]等多方面的生物學(xué)功能,因此在功能食品、飼料、化妝品和醫(yī)藥等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[5]。

      紅發(fā)夫酵母所產(chǎn)蝦青素是胞內(nèi)色素,菌體的高密度生長使蝦青素產(chǎn)量增加,通過營養(yǎng)物的流加分批培養(yǎng)能夠達(dá)到高密度菌體培養(yǎng)的目的。在搖瓶培養(yǎng)基成分優(yōu)化組合研究的基礎(chǔ)上[6],對紅發(fā)夫酵母的5 L反應(yīng)器進(jìn)行了發(fā)酵規(guī)律的研究。

      1 材料與方法

      1.1 菌株

      紅發(fā)夫酵母菌株P(guān)haffia rhodozyma由華南理工大學(xué)生化工程研究所馴化保存。

      1.2 培養(yǎng)基

      1.2.1 斜面培養(yǎng)基(g/L)

      葡萄糖 20,酵母粉 3,蛋白胨 5,麥芽汁 3,瓊脂20,pH5。

      1.2.2 液體種子培養(yǎng)基(g/L)

      葡萄糖20,酵母粉3,蛋白胨5,麥芽汁3,pH 5。

      1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)

      混合碳源(糖蜜40%、淀粉塘60%)30,混合氮源(玉米漿 40%、硫酸銨 60%)7,MgSO4·7H2O 1.5,(NH4)3C6H5O72,Na2HPO42.0,pH 5。

      1.3 主要儀器與設(shè)備

      高效液相色譜儀:美國安捷倫公司(型號:DG-2);紫外分光光度計(jì):澳大利亞GBC科儀公司(型號:CINTRA20);電子分析天平:瑞士制造(型號:AG204);生化培養(yǎng)箱:澳大利亞Thermoline(型號:WEST6100);低溫?fù)u床:美國BRUNSWICK科學(xué)有限公司(型號:Innova4330);超凈工作臺:蘇凈集團(tuán)安泰公司;冷凍離心機(jī):日本日立公司(型號:CF7D2);pH計(jì):美國Sartorius公司;電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱:上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;立式電熱壓力蒸汽消毒器:浙江紹興醫(yī)療器械廠(型號:YXQ.L31.400);手提式壓力蒸汽消毒器:江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠(型號:YX-280);發(fā)酵罐:德國BBrau公司生產(chǎn)的5 L反應(yīng)器;光學(xué)顯微鏡:無錫照相器材廠(型號:L-1000);恒溫水浴鍋:深圳天南地北實(shí)業(yè)有限公司。

      1.4 培養(yǎng)方法

      1.4.1 菌種保藏

      1)菌株接入斜面培養(yǎng)基,20℃培養(yǎng)48 h,4℃保藏,每月傳代1次;

      2)20℃培養(yǎng)48 h,離心后加無菌新鮮培養(yǎng)基和甘油,甘油濃度10%~20%,-70℃~-80℃低溫冷凍保藏。

      1.4.2 種子培養(yǎng)

      將一環(huán)菌苔(20℃培養(yǎng)3 d~4 d的斜面種)接種于250mL的錐形瓶,20℃、150r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h。

      1.4.3 搖瓶培養(yǎng)

      250 mL錐形瓶中裝30 mL培養(yǎng)基,滅菌后以8%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入培養(yǎng)48 h的種子液,20℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。

      1.4.4 生物反應(yīng)器培養(yǎng)

      反應(yīng)器和培養(yǎng)基滅菌后以8%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入培養(yǎng)48 h的種子液,控制通氣和攪拌,按照一定的方式補(bǔ)料,并定時取樣測定數(shù)據(jù)。培養(yǎng)過程中維持溫度為20℃,培養(yǎng)液pH為5.0。

      1.5 測定方法

      1.5.1 酵母生物量的測定

      取10 mL培養(yǎng)液,3000 r/min離心10 min,倒掉上清液,用蒸餾水離心洗滌2次后再用蒸餾水將菌體移入預(yù)先干燥至恒重M0的稱量瓶中,置于105℃電熱恒溫干燥箱中干燥至恒重,用精密電子天平稱量稱量瓶和菌體總重M,則生物量可用下式計(jì)算:

      1.5.2 培養(yǎng)液中殘?zhí)堑臏y定

      采用菲林試劑快速滴定法測定總糖。

      1.5.3 蝦青素的提取[7]

      取5 mL培養(yǎng)液,離心分離洗滌3次,加3 mL 3 mol/L HCl,沸水浴3 min,迅速冷卻,離心分離洗滌2次,添加5 mL甲醇振蕩提取1 min,離心取上清液。如果提取不完全,再加甲醇提取,直至菌體無色。提取液置冰箱冷藏至測定。

      1.5.4 蝦青素測定[8]

      采用 HPLC 測定。流動相為 φ甲醇:φ乙腈=9:1,流動相流速為1.0 mL/min,柱溫為30℃,PDA檢測器在474 nm處進(jìn)行蝦青素分析。以Sigma公司的蝦青素作為標(biāo)準(zhǔn)樣。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 分批培養(yǎng)

      將經(jīng)活化培養(yǎng)48 h的種子液按8%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入含3.5 L培養(yǎng)基的5 L反應(yīng)器中,培養(yǎng)溫度20℃,初期控制溶氧50%,后期由于耗氧增加,控制在40%。不補(bǔ)料也不控制pH,每12 h測定生物量、降糖曲線、pH變化曲線、蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量變化曲線。5 L反應(yīng)器分批培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線如圖1所示。

      圖1 5 L反應(yīng)器分批培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線Fig.1 Growth curves of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

      從圖1可知,0 h~12 h為延遲期,紅發(fā)夫酵母生物量增加不明顯,耗糖速率較慢;12 h~36 h為指數(shù)生長期,生物量增加明顯,耗糖速率很快,12h生物量1.61g/L,而36 h的生物量10.46 g/L;36 h~84 h為減速期,生物量增加和耗糖速率減慢,60 h生物量16.91 g/L,殘?zhí)莾H剩2.5 g/L;84 h~120 h為靜止期,生物量和殘?zhí)亲兓淮螅?4 h生物量最高17.68 g/L,120 h生物量17.61 g/L。5 L反應(yīng)器分批培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線如圖2所示。

      圖2 5 L反應(yīng)器分批培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線Fig.2 Astaxanthin curves of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

      從圖2可知,在指數(shù)生長期內(nèi),蝦青素合成速率較快。12 h蝦青素含量僅為50 μg/g;此后平滑上升,36 h蝦青素含量283 μg/g;36 h~48 h,蝦青素大量合成,蝦青素含量和產(chǎn)量突增,48 h蝦青素含量591 μg/g,產(chǎn)量8.28 mg/L。此后,蝦青素合成速率減慢,108 h蝦青素含量最高768 μg/g,蝦青素產(chǎn)量也最高13.54 mg/L。5 L反應(yīng)器分批培養(yǎng)pH變化曲線如圖3所示。

      從圖3可知,分批培養(yǎng)pH的變化過程。0 h~24 h pH 下降,24 h pH4.44;24 h~36 h 上升,36 h pH6.74;48 h pH下降后,逐漸回升至6.50左右,并基本維持在這個水平。這說明在培養(yǎng)初期隨著糖分的消耗,產(chǎn)生較多的酸性物質(zhì),導(dǎo)致pH值下降,糖分消耗完后,堿性物質(zhì)增多,pH再度上升。

      圖3 5 L反應(yīng)器分批培養(yǎng)pH值變化曲線Fig.3 pH curve of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

      2.2 pH-stat控制流加培養(yǎng)

      pH-stat控制流加培養(yǎng)是補(bǔ)料分批培養(yǎng)的一種,即通過流加控制pH基本恒定在最佳值。補(bǔ)料分批培養(yǎng)是一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的操作方式,在進(jìn)行分批培養(yǎng)的時候,向反應(yīng)器加入培養(yǎng)基的一種或多種成分,以達(dá)到延長生產(chǎn)期和控制培養(yǎng)過程的目的。

      2.2.1 酸堿流加培養(yǎng)

      將經(jīng)活化培養(yǎng)48 h的種子液按8%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入含3.5 L培養(yǎng)基的5 L反應(yīng)器中,培養(yǎng)溫度20℃,初期控制溶氧50%,后期由于耗氧增加,控制在40%。pH用濃氨水和10%的硫酸控制在5.0左右,每12 h測定生物量、降糖曲線、pH變化曲線、蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量變化曲線。5 L反應(yīng)器pH-stat流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線如圖4所示。

      圖4 5 L反應(yīng)器pH-stat流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線Fig.4 Growth curves of pH-stat fed-batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

      從圖4可知,酸堿流加培養(yǎng)很好的控制pH在5.00左右,因此酵母細(xì)胞生長比沒有控制pH值的分批培養(yǎng)要好。12 h細(xì)胞生物量4.68 g/L;24 h~48 h為指數(shù)生長期,耗糖速率較快;48 h生物量16.97 g/L,高于同期分批培養(yǎng)生物量,提高了21.13%;此后減速,84 h到108 h為靜止期,84 h生物量最高18.65 g/L,相對于分批培養(yǎng)生物量最高值提高了5.5%。5 L反應(yīng)器pH-stat流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線如圖5所示。

      圖5 5 L反應(yīng)器pH-stat流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線Fig.5 Astaxanthin curves of pH-stat fed-batch of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

      從圖5可知,在指數(shù)生長期內(nèi),蝦青素合成速率較快,相對于分批培養(yǎng)上升比較平穩(wěn)。12 h蝦青素含量僅為140 μg/g;此后逐漸上升,36 h蝦青素含量285 μg/g;36 h~48 h,蝦青素大量合成,蝦青素含量和產(chǎn)量突增,48 h蝦青素含量535 μg/g,產(chǎn)量9.05 mg/L;此后,蝦青素積累繼續(xù)增加,96 h蝦青素含量最高851 μg/g,蝦青素產(chǎn)量也最高15.82 mg/L,相對于分批培養(yǎng)要早12 h,也提高了10.8%和16.8%。

      2.2.2 混合碳源-氨水流加培養(yǎng)

      將經(jīng)活化培養(yǎng)48 h的種子液按8%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入含3.5 L培養(yǎng)基的5 L反應(yīng)器中,培養(yǎng)溫度20℃,初期控制溶氧50%,后期由于耗氧增加,控制在40%。以混合碳源(糖蜜和淀粉糖)代替硫酸,用氨水代替氫氧化鈉來響應(yīng)發(fā)酵pH變化的一種偶聯(lián)補(bǔ)料培養(yǎng)模式,10%氨水控制pH在5.00,當(dāng)pH超過5.00時,由反應(yīng)器系統(tǒng)自動泵啟動流加碳源,從而達(dá)到流加碳源和氮源的目的。每12 h測定生物量、降糖曲線、pH變化曲線、蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量變化曲線。5 L反應(yīng)器pH-stat混合碳源流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線如圖6所示。

      從圖6可知,由于24 h到36 h,培養(yǎng)液pH值上升很快,超過5.00,反應(yīng)器系統(tǒng)自動流加混合碳源,殘?zhí)菑?4 h14.8 g/L增加到36 h的22.1 g/L,此后基本控制pH在5.00左右,12 h細(xì)胞生物量2.9 g/L,由于流加了混合碳源,延長了細(xì)胞生長期;從24 h~96 h生物量一直在顯著增長,96 h生物量27.51 g/L,高于同期酸堿流加培養(yǎng)生物量,提高了47.8%;此后減速,96 h到120 h為平穩(wěn)期,120 h生物量最高28.12 g/L,相對于酸堿流加培養(yǎng)生物量最高值提高了50.7%。5 L反應(yīng)器pH-stat混合碳源流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線如圖7所示。

      圖6 5 L反應(yīng)器pH-stat混合碳源流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線Fig.6 Growth curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by pH-stat feeding with mixture carbon sources

      圖7 5 L反應(yīng)器pH-stat混合碳源流加培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線Fig.7 Astaxanthin curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by pH-stat feeding with mixture carbon sources

      從圖7可知,在指數(shù)生長期中前期,蝦青素合成速率較快,相對于酸堿流加培養(yǎng)上升更明顯。12 h蝦青素含量僅為162 μg/g,此后蝦青素大量合成,蝦青素含量和產(chǎn)量突增,36 h蝦青素含量531 μg/g,到72 h蝦青素含量最高802 μg/g,相對于酸堿流加培養(yǎng)蝦青素含量最高值下降了,這是由于生物量大大增加引起的。96 h蝦青素產(chǎn)量達(dá)到最高19.94 mg/L,相對于酸堿流加培養(yǎng)蝦青素產(chǎn)量最高值提高了26%。

      2.2.3 混合碳源-尿素流加培養(yǎng)

      將經(jīng)活化培養(yǎng)48 h的種子液按8%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入含3.5 L培養(yǎng)基的5 L反應(yīng)器中,培養(yǎng)溫度20℃,初期控制溶氧50%,后期由于耗氧增加,控制在40%。以混合碳源(糖蜜和淀粉糖)代替硫酸,以尿素代替氨水來響應(yīng)發(fā)酵pH變化的一種偶聯(lián)補(bǔ)料培養(yǎng)模式,其中尿素和硫酸銨以4:1混合,相當(dāng)于10 g/L的硫酸銨,當(dāng)pH超過5.00時,由反應(yīng)器系統(tǒng)自動泵啟動流加碳源,從而達(dá)到流加碳源和氮源的目的。每8小時測定生物量、降糖曲線、蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)量變化曲線。5 L反應(yīng)器流加混合碳源-尿素培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線如圖8所示。

      圖8 5 L反應(yīng)器流加混合碳源-尿素培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母生長曲線Fig.8 Growth curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by feeding carbamide and mixture carbon sources

      由圖8可知,在對數(shù)生長期細(xì)胞生長較快,比生長速率為3.70×10-2h-1。在64 h開始流加尿素后,細(xì)胞生長減緩。培養(yǎng)到144 h,生物量達(dá)到30.81 g/L。由圖8還可以看到,繼續(xù)培養(yǎng)生物量開始下降,說明細(xì)胞開始老化死亡。

      本次試驗(yàn)共流加約298 g糖分;初始培養(yǎng)液體積為3.5 L,糖濃度為35.22 g/L,含糖量為123.3 g;最終培養(yǎng)液體積4.5 L,殘?zhí)菨舛?.52 g/L,含糖量為42.8 g,故整個培養(yǎng)過程中實(shí)際耗糖量為378.5 g;生物量最終達(dá)到30.20 g/L,共計(jì)135.9 g,故糖分轉(zhuǎn)化為酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率為0.359。5 L反應(yīng)器流加混合碳源-尿素培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線如圖9所示。

      圖9 5 L反應(yīng)器流加混合碳源-尿素培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母蝦青素變化曲線Fig.9 Astaxanthin curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by feeding carbamide and mixture carbon sources

      由圖9可知,在136 h前,蝦青素產(chǎn)量呈持續(xù)增長狀態(tài),并于136 h達(dá)到最大產(chǎn)量28 mg/L。136 h以后繼續(xù)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)蝦青素產(chǎn)量和含量同步迅速下降,估計(jì)是酵母細(xì)胞進(jìn)入衰亡期的原因。蝦青素含量在對數(shù)期增長較快,在加入尿素后,蝦青素含量穩(wěn)步增大,并于136 h 達(dá)到最大值 923 μg/g。

      3 結(jié)論

      pH-stat控制流加培養(yǎng)相對于不控制pH-stat的分批培養(yǎng),紅發(fā)夫酵母的生物量、蝦青素含量和產(chǎn)量都有顯著提高。但是,不同方式進(jìn)行pH-stat控制流加培養(yǎng)的結(jié)果也有差異,以混合碳源(糖蜜和淀粉糖)代替硫酸,用氨水代替氫氧化鈉來響應(yīng)發(fā)酵pH變化的偶聯(lián)補(bǔ)料培養(yǎng)模式,不僅能維持最適pH值,同時也流加了混合碳源,延長了細(xì)胞生長期,但各項(xiàng)指標(biāo)最高值出現(xiàn)的時間并沒有推遲,相對于酸堿流加培養(yǎng)生物量最高值提高了50.7%,蝦青素產(chǎn)量最高值提高了26%。以混合碳源(糖蜜和淀粉糖)代替硫酸,以尿素代替氨水來響應(yīng)發(fā)酵pH變化的偶聯(lián)補(bǔ)料培養(yǎng)模式,能同時達(dá)到流加碳源和氮源的目的,生物量、蝦青素產(chǎn)量及含量均達(dá)到了較高水平,但是流加尿素蝦青素合成積累較慢,培養(yǎng)時間過長,影響其實(shí)際生產(chǎn)操作的可行性。因此,以混合碳源代替硫酸,用氨水代替氫氧化鈉來響應(yīng)發(fā)酵pH變化的偶聯(lián)補(bǔ)料培養(yǎng)模式是比較理想的方式。

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      Study on Astaxanthin Production of Phaffia rhodozyma in pH-stat Fed-batch Cultures

      ZHU Xiao-li1,LIANG Shi-zhong2,DENG Mao-cheng1,ZHU Ming-jun2
      (1.Department of Food and Biology Engineering,Guangdong Industry Technical College,Guangzhou 510300,Guangdong,China;2 College of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,Guangdong,China)

      The growth and astaxanthin production of Phaffia rhodozyma in pH-stat fed-batch cultures with different feeding methods and grown at specific growth rates similar to the batch culture was compared.The results described that fed-batch culture was better than the batch culture.The different feeding methods included acid-alkali,compound carbon sources and ammonia,compound carbon sources and urea fed-batch culture.To the end of achieving and the cost efficiency of astaxanthin production,compound carbon sources and ammonia fed-batch culture was the best method,the highest astaxanthin production was 19.94 mg/L at 96 h culture time.

      Phaffia rhodozyma;astaxanthin;pH-stat;fed-batch culture

      廣東省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2002C1040101);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2003Z2-E0131)

      朱曉立(1980—),男(漢),工程師,講師,碩士,研究方向:食品生物技術(shù)。

      2010-08-27

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