張緒斌 熊正文 張華東

解放軍第251醫(yī)院,河北省張家口市 075000

骨組織不同于一般的軟組織,是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織,由粘多糖和一些膠原纖維樣骨膠纖維構(gòu)成的骨樣組織和沉著于其中的無(wú)機(jī)鹽(骨鹽)形成的。無(wú)機(jī)鹽以羥基磷灰石結(jié)晶的形式存在,其中絕大部分為水合磷酸鈣,此外還包括微量碳酸鹽和檸檬酸鹽等[1,2],因此骨和其他一些已鈣化的組織在脫水、透明等制片前必須將組織中的鈣鹽用脫鈣劑除去,才能制成4～5μm厚的切片。目前,常用的脫鈣劑主要有單純酸類、混合酸類、螯合劑、離子交換樹脂和電解脫鈣等方法[3～6],尤其是近年來(lái)應(yīng)用微波技術(shù)輔助脫鈣明顯縮短了脫鈣時(shí)間,改善了HE、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)染色和原位雜交[7～11]。現(xiàn)將骨組織的脫鈣技術(shù)及應(yīng)用等有關(guān)內(nèi)容簡(jiǎn)介如下。

1 骨組織的組織學(xué)特點(diǎn)[1,2]

骨組織由骨基質(zhì)和骨細(xì)胞組成,骨基質(zhì)是由有機(jī)物質(zhì)和無(wú)機(jī)物質(zhì)緊密結(jié)合而成,主要成分有:(1)膠原纖維:為Ⅰ型膠原;(2)粘蛋白:為膠原纖維間的無(wú)定型物質(zhì);(3)骨鹽:主要是羥基磷灰石;(4)酶:包括堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和膠原酶等。軟骨基質(zhì)是由軟骨母細(xì)胞分泌豐富的蛋白多糖組成的,HE染色呈淡藍(lán)色,A lcian藍(lán)染色陽(yáng)性(藍(lán)色),甲苯胺藍(lán)呈異染性反應(yīng)(紫紅色),軟骨的膠原屬Ⅱ型膠原。

骨及軟骨的細(xì)胞成分有:(1)骨母細(xì)胞,其形態(tài)與靜止及活躍狀態(tài)有關(guān),前者呈梭形;后者常為多邊形或橢圓形。胞體大、核偏位、胞漿豐富、嗜堿性。骨母細(xì)胞能產(chǎn)生骨樣基質(zhì),由骨樣基質(zhì)與其周邊的骨母細(xì)胞構(gòu)成了骨樣組織,HE染色呈粉紅;(2)骨細(xì)胞位于骨陷窩內(nèi),常呈小梭形;(3)軟骨母細(xì)胞,胞體為卵圓形,常伴隨軟骨基質(zhì)而存在;(4)破骨細(xì)胞(Osteoclast)為一種多核巨細(xì)胞,可有10～20個(gè)核,核淡染,有核仁,胞漿嗜酸有突起,電鏡下可見(jiàn)微絨毛,破骨細(xì)胞含有豐富的酸性磷酸酶和膠原酶。

2 骨組織的固定

由于骨組織致密、堅(jiān)硬,并含有骨膠等成分,所以骨組織的固定、脫水、透明、包埋等都很困難。不論是HE染色、組化染色,還是免疫組織化學(xué)染色都要求將組織及時(shí)固定,其目的是為了保存良好的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、防止組織自溶,阻止內(nèi)、外源性細(xì)胞內(nèi)分解酶活性和保存某些特殊抗原[1,12]。骨組織固定的方法主要有先固定后脫鈣、固定脫鈣同時(shí)進(jìn)行和先脫鈣后固定三種方式[13]。

常用的固定劑主要有福爾馬林、多聚甲醛、戊二醛、丙酮、乙醇及碳化二亞銨等,它們都具有良好的固定作用。固定不當(dāng)對(duì)抗原性有很大的影響,主要表現(xiàn)在三個(gè)方面,一是組織過(guò)大固定時(shí)間不夠,使組織中心部位的抗原溶解、彌散或丟失;二是在福爾馬林固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng),因醛-氨基交聯(lián)而降低抗原性;三是固定液的種類、濃度和溫度對(duì)一些特殊抗原有很大的破壞作用[1,12]。離體組織應(yīng)采用10%的福爾馬林或4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)及時(shí)浸泡固定,也可用120～150W 的微波(microwave,MW)輔助固定液、或生理鹽水固定3～5m in,組織塊的大小以1.2cm×0.8cm×0.2cm為好,需電鏡檢查的材料可加入0.05%～0.5%的戊二醛[2]。

3 骨組織的常用脫鈣方法及脫鈣液

3.1 單純酸類脫鈣劑 主要有甲酸、硝酸、鹽酸、三氯乙酸和硫酸等,尤其是甲酸和硝酸在骨組織的脫鈣中應(yīng)用較其他單純酸多[9,13]。甲酸又稱蟻酸,是一種良好的常規(guī)脫鈣劑,其作用緩慢,對(duì)組織損害小,使用濃度5%～50%,濃度越高、脫鈣時(shí)間越短,使用時(shí)應(yīng)隨時(shí)注意觀察[9,13]。通過(guò)對(duì)比5%、8%、10%和13%硝酸脫鈣液的濃度,以8%～10%濃度的硝酸,脫鈣效果最好。8%硝酸室溫下脫鈣骨密質(zhì)需要24～36h,骨松質(zhì)需要12～24h,蠟塊中的組織塊及切片均呈淡黃色,陽(yáng)性免疫組織化學(xué)染色極差,背景較深。硝酸是臨床病理活檢中最實(shí)用的一種常規(guī)脫鈣劑,脫鈣迅速、完全可靠、作用強(qiáng)、時(shí)間短、效果好,但是對(duì)骨組織的破壞作用較大[13]。采用低溫MW-8%硝酸脫鈣骨密質(zhì)需要50～55min,骨松質(zhì)需要30～35m in,其石蠟切片完整、HE染色對(duì)比好,IHCS標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞比室溫條件下硝酸脫鈣的多、著色深、背景最淡[5,6,9]。使用硝酸脫鈣時(shí)由于亞硝酸形成使組織呈黃色而影響其后的染色,在室溫條件下更明顯,在純硝酸中加入0.1%的尿素可防止變黃。

3.2 混合酸類脫鈣劑 混合酸類脫鈣液是指兩種酸類脫鈣劑一起使用,或在單純酸內(nèi)加入另一種脫鈣劑或少量的其他試劑所配制的脫鈣液,這類脫鈣液的特點(diǎn)是脫鈣完全、快速,防止纖維組織過(guò)度膨脹,減少組織破壞及對(duì)染色的影響。通過(guò)加入不同的化學(xué)成分可以彌補(bǔ)單純酸類脫鈣液的不足,所以混合酸類脫鈣液越來(lái)越受到人們的歡迎。常用的混合酸類脫鈣液主要有甲酸-甲醛脫鈣液、甲酸-檸檬酸鈉液、Schm orl's液、Von Ebner氏液、Jenkins氏液、Plank-Rycho 氏液、Richman 氏液、Jy-Ⅰ 、Jy-Ⅱ氏液、Schcidde氏液等[9,13]。

3.3 螯合劑脫鈣技術(shù) 螯合劑屬于有機(jī)化合物,因其可與金屬離子結(jié)合而把它作為脫鈣劑使用,如乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、檸檬酸鈉等。檸檬酸鈉對(duì)組織損害較大、產(chǎn)生氣泡、脫鈣時(shí)間長(zhǎng),所以很少使用。EDTA具有對(duì)組織破壞小、不產(chǎn)生氣泡、不影響染色、pH值近中性等優(yōu)點(diǎn),所以使用較多。在4%、7%、10%、13%和16%EDTA脫鈣液濃度中,以10%、13%濃度的脫鈣效果最好。室溫下使用EDTA脫鈣(20℃),骨密質(zhì)需要 35～40d,骨松質(zhì)需要30～35d,石蠟切片完整,HE染色對(duì)比好,IHCS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多、著色深、背景淡。低溫MW-10%EDTA脫鈣,骨密質(zhì)需要9～10h,骨松質(zhì)需要7～8h,石蠟切片、HE及IHCS比室溫條件下脫鈣好、時(shí)間明顯縮短[1,10,14]。

3.4 離子交換樹脂技術(shù) 離子交換樹脂脫鈣是一種非常理想的脫鈣技術(shù),它能使脫鈣液中的鈣離子快速除去,確保骨組織中鈣能充分地、通暢地溶出,以最大程度地提高脫鈣液的效率,加速脫鈣速度,縮短脫鈣時(shí)間,為HE、組化和免疫組化染色提供有利條件。其方法是將氨型磺化聚苯乙烯樹脂鋪在脫鈣容器底部厚度約1.5cm,將脫鈣組織放在樹脂上面,加入有機(jī)酸(不可加入無(wú)機(jī)酸)脫鈣液,脫鈣液的用量為脫鈣組織體積的20～30倍[13]。

3.5 電解脫鈣技術(shù) 電解脫鈣是將兩電極插入脫鈣液中,使脫鈣液內(nèi)有電流通過(guò),將脫鈣液中的鈣離子吸引到陰極而發(fā)生電離作用,加速脫鈣過(guò)程、縮短脫鈣時(shí)間,尤其是大量標(biāo)本脫鈣或是標(biāo)本體積大時(shí)效果更好。電解脫鈣的原理是在容器內(nèi)裝脫鈣液150m l,取一根鉑金絲將標(biāo)本纏繞數(shù)圈,放在容器一側(cè),鉑金絲另一端連接電源正極,在容器另一側(cè),將一支鋼片或炭精棒的下端插入電解脫鈣液內(nèi),上端與電源負(fù)極相接,在正、負(fù)極之間隔置一塊絕緣的有機(jī)玻璃或塑料板,以防電極接觸而引起導(dǎo)電,將已裝好的導(dǎo)電裝置置于37～45℃恒溫水浴箱中,接通電源即可脫鈣。此方法簡(jiǎn)便易行,染色效果好,一般數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)即可完成脫鈣[3]。

3.6 脫鈣機(jī)脫鈣技術(shù) 近年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,骨組織的脫鈣技術(shù)也有了新的發(fā)展,利用超聲波、電離等技術(shù)生產(chǎn)的脫鈣機(jī)也應(yīng)運(yùn)而生,但由于經(jīng)濟(jì)狀況和技術(shù)條件的限制,目前國(guó)內(nèi)大部分實(shí)驗(yàn)室都還不具備這種設(shè)備。脫鈣機(jī)脫鈣技術(shù)尚不十分完善,目前國(guó)外的脫鈣機(jī)主要為加熱恒溫法、超聲波法、電離法、真空負(fù)壓法等,但這些方法都需要酸類脫鈣劑參與,脫鈣液對(duì)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原性的破壞,對(duì)染色的影響還是不可避免。脫鈣機(jī)加快了脫鈣速度,縮短了脫鈣時(shí)間,減少了長(zhǎng)時(shí)間脫鈣對(duì)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原性等的損害,使脫鈣效果更好,解決了人工無(wú)法解決的許多技術(shù)難題[13]。

4 骨組織的低溫-微波快速脫鈣技術(shù)研究

4.1 微波特性生物物理學(xué)持性與應(yīng)用 MW是一種高頻電磁波,頻率為300～300 000MHz,波長(zhǎng)1mm～1m,生物醫(yī)學(xué)中常用的頻率為 2 450、915、434MHz,目前微波爐所用頻率為2 450MH z,波長(zhǎng)12.5cm。MW的透入深度與頻率成反比,與波長(zhǎng)成正比,頻率高,波長(zhǎng)短,其輻射方向性好,能量易于集中,但透入深度小;反之則方向性差,能量不易于集中,透入深度大。MW與光波不同,屬于非電離輻射,不能使鍵能最弱的氫鍵斷裂。當(dāng)MW作用于生物體或介質(zhì)時(shí),因吸收MW而使溫度升高,發(fā)生熱效應(yīng)。MW不發(fā)生熱傳遞,熱效應(yīng)產(chǎn)生的多少與生物體內(nèi)的水分、介質(zhì)中的極性分子或離子濃度等成正比。MW產(chǎn)熱的原理是排列混亂的極性分子、離子等在電場(chǎng)力的作用下使它們振動(dòng)、運(yùn)動(dòng)、相互摩擦、碰撞,而產(chǎn)生熱量,使組織細(xì)胞或介質(zhì)的溫度升高[2,15]。

自從MW首次用于固定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)材料獲得成功,隨后大量的研究結(jié)果證實(shí),MW在常規(guī)制片、冰凍切片、組化、免疫組化、原雜交和電鏡制片等領(lǐng)域均獲得了十分好的效果[2,8,11,16]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)對(duì)臨床病理活體檢查骨組織的脫鈣及脫鈣液有較多的研究,但對(duì)IHCS所用材料的研究較少,國(guó)外學(xué)者在內(nèi)耳的免疫組化研究中使用EDTA脫鈣獲得了較好的效果,但所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3～4周,有的甚至需數(shù)月(4～7個(gè)月),很難滿足臨床活檢病理診斷和研究的需要[10,17]。

4.2 骨組織的低溫-微波快速脫鈣技術(shù)研究 根據(jù)MW熱效應(yīng)的原理,在對(duì)脫鈣液的種類、脫鈣溫度等進(jìn)行較深入研究的基礎(chǔ)上,將MW與硝酸、EDTA等脫鈣液相結(jié)合,創(chuàng)用的“低溫MW-快速脫鈣技術(shù)”,使脫鈣組織的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗原性均得到了很好的保存,而且脫鈣時(shí)間顯著縮短,在骨腫瘤和內(nèi)耳等的IHCS中收到了很好的效果[1,11,17]。研究結(jié)果顯示[1,2,18,19]:(1)鈣液的溫度對(duì)IHCS結(jié)果有十分明顯的影響,低溫條件下脫鈣對(duì)抗原性有很好的保護(hù)作用;(2)脫鈣液的種類對(duì)抗原性無(wú)明顯影響;(3)將低溫微波技術(shù)與硝酸、甲酸和EDTA等脫鈣方法結(jié)合,由于縮短了脫鈣時(shí)間,使抗原性得到了很好的保存;(4)合理使用抗原修復(fù)技術(shù)可以使石蠟切片或冰凍切片的抗原性得到很好的恢復(fù);(5)石蠟切片比冰凍切片能更好的保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

4.3 低溫MW-硝酸快速脫鈣的方法[2,6,14](1)取4～5個(gè)月齡豚鼠耳蝸、家兔的后腿骨及骨腫瘤等待脫鈣的骨及脫化組織,大小為 l.2cm×0.8cm×0.4cm,用10%福爾馬林固定12h、流水沖洗0.5～1h。(2)在1 000m l的大燒杯內(nèi)放500m l冰水。(3)在500m l的小燒杯內(nèi)放250m l經(jīng)冰箱預(yù)冷的硝酸或EDTA脫鈣液,然后放待脫鈣的組織。(4)將小燒杯放入大量杯內(nèi),然后一同放入微波爐中。(5)用2檔(微波輸出功率250W)脫鈣,并測(cè)量大、小燒杯中液體的溫度。當(dāng)接近15℃時(shí)向大燒杯中添加冰塊,或向小燒杯中添加預(yù)冷的脫鈣液,這樣脫鈣液溫度不會(huì)迅速升高,又發(fā)揮了微波效應(yīng)的作用,保證了脫鈣液的溫度始終控制在15℃以內(nèi)。低溫MW-硝酸快速脫鈣技術(shù)的關(guān)鍵是通過(guò)脫鈣液在冰箱中預(yù)冷、及時(shí)更換脫鈣液和在裝脫鈣液容器之外的大容器中添加冰塊,使脫鈣液不至于因?yàn)槲⒉嵝?yīng)的作用而使溫度迅速升高。

5 脫鈣方法的對(duì)比研究

1993年Walsh等[7]對(duì)硝酸、蟻酸和EDTA 脫鈣的組織進(jìn)行了m RNA原位雜交,他認(rèn)為蟻酸和EDTA比硝酸能真實(shí)反應(yīng)組織中m RNA實(shí)際含量。Shibata等[8]研究了 10%硝酸、10%鹽酸、5%蟻酸、5%三氯醋酸、M orse液、Plank-Rycho氏液和K-CX液共7種脫鈣液對(duì)rRNA原位雜交染色效果的影響,結(jié)果顯示5%蟻酸和 M orse液最好。Yam am oto-Fuku等[9]也用DNA組織化染色和原位末端缺口標(biāo)記評(píng)價(jià)了 10%EDTA、5%三醋酸、Morse液、5%蟻酸、5%鹽酸、10%硝酸、Plank-Rycho氏液和K-CX液共8種脫鈣液的脫鈣效果,結(jié)果顯示 10%EDTA、5%三氯醋酸、M orse液和5%蟻酸可用于DNA組織化學(xué)染色;10%EDTA、5%蟻酸可用于DNA原位末端缺口標(biāo)記,而其他脫鈣液均不行。有學(xué)者通過(guò)對(duì)8%硝酸、甲酸-甲醛混合液、20%甲酸液、Jenkins液、10%EDTA 5種脫鈣液分別在低溫微波15℃組(Ⅰ組)、冰箱4℃(Ⅱ組)、室溫20℃(Ⅲ組)和溫箱37℃(Ⅳ組)條件下脫鈣的對(duì)比,免疫組織化學(xué)染色、圖像分析檢測(cè)ANP、5-H T 、S-100、NF、GFAP 和 Vimentin 的染色。結(jié)果以硝酸作為脫鈣劑時(shí),Ⅰ組(1.89+0.97)陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值與Ⅱ組(1.81+1.02)相近,均顯著高于Ⅲ(1.03+0.85)、Ⅳ(0.76+0.85)組;脫鈣液的溫度越高,陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值越低,脫鈣時(shí)間越短。研究結(jié)果證實(shí)低溫-MW硝酸脫鈣技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得滿意的IHCS染色效果[18～20]。

6 骨組織脫鈣的注意事項(xiàng)

骨組織脫鈣應(yīng)注意以下幾點(diǎn)[1,9,13,18～20]:(1)脫鈣時(shí)間應(yīng)根據(jù)所用的脫鈣劑不同種類;不同的骨組織、骨密質(zhì)、骨松質(zhì)和組織塊的大小等具體情況而確定脫鈣時(shí)間。(2)低溫-MW脫鈣的關(guān)鍵是保持脫鈣液的溫度始終控制在15℃以內(nèi),盡量減少脫鈣液溫度過(guò)高等人為因素對(duì)組織結(jié)構(gòu)、抗原性等的破壞作用。(3)骨組織取材不宜過(guò)厚,一般應(yīng)在5mm左右,以負(fù)脫鈣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成組織形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞和染色效果不佳。(4)脫鈣容器不能使用金屬制品,而且脫鈣液的用量要充足,一般為標(biāo)本的20～30倍,其中更換新液1～2次。(5)骨組織一般應(yīng)先固定后脫鈣,或脫鈣、固定同時(shí)進(jìn)行,未經(jīng)骨定的骨組織不宜脫鈣,同時(shí)脫鈣液也不宜加溫。(6)注意脫鈣“終點(diǎn)”的鑒定,脫鈣“終點(diǎn)”的鑒定主要有物理檢測(cè)、X線照相技術(shù)和化學(xué)檢測(cè)法。

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