驅(qū)白巴布期膠囊治療豚鼠實驗性白癜風(fēng)作用研究*

彭英，霍仕霞，康雨彤，閆明

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，832000;2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049)

白癜風(fēng)是一種常見的皮膚疾病，其發(fā)病機制尚不清楚，存在自身免疫學(xué)說、黑素細(xì)胞自毀學(xué)說等假說。其中黑素細(xì)胞學(xué)說中的黑素減少是本病的表觀顯示指標(biāo)，可能與本病的發(fā)生有直接聯(lián)系，黑素細(xì)胞的生成過程又與酪氨酸酶直接相關(guān)。筆者在本實驗以維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的傳統(tǒng)復(fù)方驅(qū)白巴布期膠囊為研究對象，通過動物實驗考察其對實驗性白癜風(fēng)的作用，對其療效做初步判斷，為進(jìn)一步進(jìn)行驅(qū)白巴布期膠囊的作用機制探討做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物 驅(qū)白巴布期膠囊由補骨脂、驅(qū)蟲斑鳩菊、高良姜、白花丹、盒果藤等5味藥材制成，由新疆華康藥業(yè)提供，批號:100140。常溫下保存，配制方法:溶解在5%羧甲基纖維素鈉水溶液中(劑量依據(jù):人臨床劑量換算成豚鼠劑量，單位:mg·kg-1·d-1)。

1.1.2 儀器 生物組織攤烤片機(KZPG-1A)，生物組織包埋機(BMG-1)，切片機(RM2235)，光學(xué)顯微鏡(LEICA DM2500)，恒溫水浴箱(上海亞榮生物儀器廠)。

1.1.3 實驗動物 黑色豚鼠112只，體質(zhì)量(250±20)g，雌雄各半，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.4 主要試劑 白靈片(佛山馮了性藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:100702)，氫醌(天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，批號:20100120)，Dopa-氧化酶(Sigma公司)，鼠抗人酪氨酸酶單克隆抗體(Sigma公司)，DAB-H2O2(Sigma公司)，Elvision試劑(Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 黑色豚鼠112只，隨機分為正常對照組、模型組、陽性藥物對照組(給予白靈片1 128 mg·kg-1·d-1)，低、中、高劑量給藥組(分別給予驅(qū)白巴布期膠囊 580，1 160，2 320 mg·kg-1·d-1)，自身恢復(fù)組，中劑量預(yù)防組(給予驅(qū)白巴布期膠囊1 160 mg·kg-1·d-1)，每組雌雄各7只。

1.2.2 白癜風(fēng)動物模型的建立 參考文獻(xiàn)［1］。脫去各組豚鼠背部黑色毛5 cm×5 cm，除正常對照組外，其他7組采用5%氫醌對黑色豚鼠進(jìn)行皮膚脫色，正常對照組豚鼠每天涂抹等量0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)涂抹30 d。在此期間，豚鼠每3 d在受試區(qū)脫毛1次。

1.2.3 給藥方法 正常對照組、模型組、自身恢復(fù)組不做任何處理，中劑量預(yù)防組從造模開始時給藥，連續(xù)給藥觀察60 d。其余各組造模30 d后開始給藥，連續(xù)觀察給藥30 d。

1.2.4 指標(biāo)檢測 治療結(jié)束后，肉眼觀察各組藥物治療豚鼠實驗性白癜風(fēng)的效果。于受試區(qū)中心取皮膚1 cm×1 cm，固定，石蠟包埋，切片后觀察黑素細(xì)胞，進(jìn)行Dopa-氧化酶染色和Lillie染色觀察豚鼠表皮黑素細(xì)胞(melanocytes，MC)、含黑素顆?；准?xì)胞、酪氨酸酶含量變化。

1.3 酷氨酸酶強度判定標(biāo)準(zhǔn) 參考文獻(xiàn)［2］。酪氨酸酶陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，顯鏡下細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒、或團(tuán)塊狀為陽性表達(dá)。采用二級計分法判定結(jié)果，陽性細(xì)胞計＜5%為0分;～25%為1分;～50%為2分;～75%為3分;＞75%為4分。按染色強度分類:淡黃色1分;黃或深黃2分;褐或棕黃色3分。兩者相加＜2分為陰性(-)，2～3分為陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行t檢驗統(tǒng)計學(xué)處理。組間計數(shù)資料比較均采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 驅(qū)白巴布期膠囊對皮膚黑色素的影響 肉眼觀察可見，用5%氫醌后，各氫醌脫色組動物受試區(qū)皮膚較正常對照組動物受試區(qū)皮膚明顯偏白。其中模型組皮膚顏色最淡，呈蒼白色，有白斑，黑毛變成黃毛，有的甚至長出白毛。中劑量預(yù)防組動物皮膚較其他氫醌脫色組動物受試區(qū)皮膚偏黑。自身恢復(fù)組動物皮膚，較其他氫醌脫色組動物受試區(qū)皮膚偏白。高、中、低劑量給藥組、陽性對照組受試區(qū)皮膚肉眼觀察無明顯差別。

2.2 MC的觀察 Dopa-氧化酶染色后，棕黑色染色為黑素細(xì)胞陽性。分別于光鏡下測定每個高倍鏡視野內(nèi)各組MC數(shù)量，每個標(biāo)本觀察10個高倍鏡視野，計算每100個表皮基底細(xì)胞中MC的平均數(shù)量。見表1，圖1。

2.3 含黑素顆粒的基底細(xì)胞計數(shù) Lillie染色后，黑色素呈暗綠色為陽性，分別于光鏡下測定各組含黑素顆粒的基底細(xì)胞數(shù)量，每個標(biāo)本觀察10個高倍鏡視野，計算每100個表皮基底細(xì)胞中含黑素顆粒的基底細(xì)胞的平均數(shù)量。見表1，圖2。

表1 8組豚鼠表皮MC計數(shù)和含黑素顆?；准?xì)胞計數(shù)Fig．1 The count of epiderm alm elanocytes and basal cell containingmelanin granules of guinea pig in 8 groups%± s，n=14

表1 8組豚鼠表皮MC計數(shù)和含黑素顆?；准?xì)胞計數(shù)Fig．1 The count of epiderm alm elanocytes and basal cell containingmelanin granules of guinea pig in 8 groups%± s，n=14

與模型組比較，*1 P＜0.01;與中劑量給藥組比較，*2 P＜0.05;與正常對照組比較，*3 P＜0.05，*4 P＜0.01Compared with themodel group，*1 P＜0.01;Compared with themedium dose group，*2 P＜0.05;Compared with the normal control group，*3 P ＜0.05，*4 P ＜0.01

組別 給藥劑量/(mg·kg-1·d-1) 表皮MC 含黑素顆?；准?xì)胞驅(qū)白巴布期膠囊低劑量給藥組 580 26.1±3.2*1 24.7±2.1*1中劑量給藥組 1 160 27.0±2.6*1 28.5±5.0*1高劑量給藥組 2 320 33.8±4.3*1 37.1±2.2*1中劑量預(yù)防組 1 160 31.1±5.9*1*2 28.9±2.0*1陽性對照組 1 128 36.2±2.3*1 29.5±5.0*1自身恢復(fù)組 … 18.5±2.5 23.9±2.7*1模型組 … 14.6±2.2*3 21.0±1.0*4正常對照組 …42.2±2.5 43.1±3.2

2.4 酪氨酸酶含量觀察 見圖3，表2。

3 討論

白癜風(fēng)是一種常見的色素障礙性皮膚病，臨床主要表現(xiàn)為黑色素減少或脫失。根據(jù)黑色素易受強氧化劑氫醌破壞的特點，參照文獻(xiàn)制備白癜風(fēng)動物模型的方法［1］，選用性質(zhì)更為穩(wěn)定的5%氫醌將豚鼠黑色皮膚脫色，連續(xù)30 d后，肉眼可見豚鼠皮膚呈蒼白色，有白斑，黑毛變成黃毛，有的甚至長出白毛。鏡下可見皮膚切片，棘層和毛囊內(nèi)黑色素減少，有的毛囊內(nèi)上、中部黑色素完全脫失，而下部有少量黑素細(xì)胞，證明本實驗?zāi)Ｐ统晒Α?/p>

在成功制備了白癜風(fēng)動物模型的基礎(chǔ)上，設(shè)置了自身恢復(fù)組、陽性對照組、中劑量預(yù)防組以及高、中、低劑量給藥組，通過連續(xù)30 d的治療，自身恢復(fù)組動物皮膚，較其他氫醌脫色組動物受試區(qū)皮膚偏白。高、中、低給藥劑量組、陽性對照藥物組受試區(qū)皮膚肉眼觀察無明顯差別。在組織學(xué)檢查中，給藥組表皮黑素分布及含黑素毛囊數(shù)明顯多于模型組(P＜0.01)，通過免疫組化結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶含量也明顯高于模型組(P＜0.01)，表明驅(qū)白巴布期膠囊在治療實驗性白癜風(fēng)上的確是有效的。

在黑素細(xì)胞的黑素生物合成過程中，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶，其活性決定著黑素合成的速度和產(chǎn)量。酪氨酸酶的表達(dá)定位于表皮基底部黑素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，為黃或棕黃色顆粒，呈局灶性或彌漫性分布。本試驗顯示與模型組動物受試區(qū)皮膚相比，高、中、低劑量給藥組酪氨酸酶表達(dá)量明顯增加，預(yù)防給藥組動物皮膚受試區(qū)酪氨酸酶的表達(dá)含量同樣高出模型組，說明驅(qū)白巴布期膠囊對酪氨酸酶的表達(dá)有促進(jìn)作用，驅(qū)白巴布期膠囊可能是通過對酪氨酸酶表達(dá)的上調(diào)作用治療白癜風(fēng)。

圖3 8組酪氨酸酶強度光鏡圖(×400)A.模型組;B.自身恢復(fù)組;C.正常對照組;D.中劑量預(yù)防組;E.高劑量給藥組;F.中劑量給藥組;G.低劑量給藥組;H.陽性對照組Fig．3 The strength of tyrosinase under lightm icroscope(×400)A.Model group;B.Self-recovery group;C.Normal control group;D.Medium dose prevention group;E.High dose treated group;F.Medium dose treated group;G.Low dose treated group;H.Positive control group

表2 8組豚鼠酪氨酸酶強度結(jié)果Tab．2 The strength tyrosinase of guinea pig in 8 groups

驅(qū)白巴布期膠囊中所含的主藥為補骨脂和驅(qū)蟲斑鳩菊，補骨脂有致光敏作用，內(nèi)服或者局部使用，使皮膚對紫外線照射敏感，容易出現(xiàn)色素沉著。補骨脂素和異補骨脂素促使皮膚黑色素的合成，并使之沉積于皮下，臨床上利用此作用來治療白癜風(fēng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，驅(qū)蟲斑鳩菊治療白癜風(fēng)的作用機制是多方面的，可通過多途徑、多靶點發(fā)揮作用［3］。本實驗研究為臨床治療白癜風(fēng)提供了一定的理論根據(jù)。

［1］ 張?zhí)m蘭，閆明，劉曉東，等.兩種化學(xué)脫色劑對兩種動物模擬白癜風(fēng)作用比較［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28(6):690-692.

［2］ 薛春雨，邢新，李蠡，等.酪氨酸酶在自體中厚移植皮片中的表達(dá)［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2005，18(5):388.

［3］ 劉銅華，維藥驅(qū)蟲斑鳩菊治療白癜風(fēng)的研究與應(yīng)用［J］.國外醫(yī)學(xué):中醫(yī)中藥分冊，2004，26(2):103.