禹亞彬，儲 建，章世海（綜述），卞建民（審校）

（南京醫(yī)科大學附屬南京市第一醫(yī)院普外科，南京 210000）

1型糖尿病和全胰切除術后的患者體內胰島素絕對缺乏。通過把有功能的胰島β細胞移植入體內來治療胰島素絕對缺乏最近幾年來引起了廣大研究者濃厚的興趣，然而胰島移植面臨著供體有限、免疫排斥等問題。已經有實驗證明了通過誘導胚胎干細胞以及胰腺、肝臟、小腸上皮中的干細胞可以較容易地獲取產胰島素細胞，但是所獲取的細胞不能隨著葡萄糖濃度的波動產生動態(tài)反應，免疫排斥，以及腫瘤形成這些問題仍然存在。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）與組織干細胞以及胚胎干細胞相比具有相當大的優(yōu)勢。MSC分化潛能巨大，不會引起免疫反應，體外可以培養(yǎng)擴增超過60代［1］，移植后組織學觀察也未發(fā)現腫瘤形成。因此，把MSC作為胰島β細胞的來源具有極大的應用前景。從骨髓、臍帶等組織中分離而來的MSC要想成功地分化為胰島β細胞尚要考慮以下這些因素。

1 細胞間接觸對MSC分化為胰島β細胞的影響

在體外，MSC分化為成熟的胰腺內分泌細胞與三維空間的形成密切相關?？赡艿脑蚴羌毎赝ㄟ^與鄰近的細胞更多的接觸來加快分化進程、促進受誘導細胞的成熟。細胞外基質凝膠擁有豐富的膠原和層粘連蛋白，為三維結構的形成提供了基礎。Gao等［2］的研究發(fā)現，在細胞外基質凝膠上培養(yǎng)的由臍帶血間充質細胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cell，UCB-MSC）分化來的細胞在形態(tài)學上更像β細胞。當UCB-MSC在缺乏ECM gel培養(yǎng)的條件下被誘導時，它的分化停留在很早的階段，在培養(yǎng)15 d后看不到胰島樣的細胞簇，也檢測不到功能性蛋白的分泌。

Huang等［3］的實驗發(fā)現，用不用胎牛血清包被的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)對UCB-MSC分化影響差別顯著。這可能是由于胎牛血清中像纖連蛋白、胎球蛋白、轉鐵蛋白這樣的蛋白加速了細胞間黏附，另外，轉鐵蛋白和鐵結合還降低了細胞毒性。

2 高糖培養(yǎng)基對MSC分化為胰島β細胞的影響

一般認為低糖培養(yǎng)液可以很好地促進細胞生長和增殖，而高糖培養(yǎng)基則不能。高糖培養(yǎng)基的影響可能是通過三個途徑:①破壞細胞膜的穩(wěn)定性;②影響細胞生長的微環(huán)境;③改變細胞內外滲透壓。但是，高濃度的糖卻被認為是MSC分化為胰島樣細胞強有力的誘導劑［4］。高濃度葡萄糖不僅可以增強胰島β細胞胰島素基因的表達，還可以刺激干細胞向胰島素分泌細胞分化［5］。因此對于MSC而言，在合適的時間添加高糖培養(yǎng)基來誘導其向胰島β細胞分化極其重要。

3 培養(yǎng)基pH對MSC分化為胰島β細胞的影響

高糖培養(yǎng)基H-DMEM容易變堿，而IMDM緩沖能力強，基本保持偏酸性。由于MSC一直生活在偏酸性的DMEM/F12培養(yǎng)基中，所以將其逐漸過渡到與之性質相似的IMDM中，既有利于細胞的生長，又提供了細胞分化的必要條件［6］。

4 在培養(yǎng)基中添加某些化學試劑可以促進MSC分化為胰島β細胞

一般認為，尼克酰胺可以通過抑制ADP核糖體多聚酶活性來保持胰島細胞的活力和功能。Chen等［7］實驗中發(fā)現單獨的高糖并不能使MSC分化為胰島樣細胞，但添加尼克酰胺后MSC則易轉化為胰島樣細胞。這意味著尼克酰胺可能是有效的誘導劑，它能保護分化的細胞死亡或者轉變?yōu)槠渌愋偷募毎?。神經元細胞和胰島內分泌細胞在起源上鄰近，都來自于內胚層。神經細胞可能是干細胞分化為胰島分泌細胞的過渡狀態(tài)［8］。神經細胞特異性表達巢蛋白，已有一部分學者先將干細胞培養(yǎng)分化為巢蛋白陽性細胞，然后再將其誘導為胰島β細胞［9，10］。β巰基乙醇通常被認為是神經細胞的誘導劑。Chen等［7］添加β巰基乙醇增加了試驗中尼克酰胺的效能。

另外，尚有學者在培養(yǎng)基中添加銀杏提取液，主要是通過增強受誘導細胞在高糖環(huán)境中的抗凋亡作用來促進其向胰島β細胞分化［11］。

5 細胞因子在MSC分化為胰島β細胞中的作用

堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是神經營養(yǎng)因子的一種，其靶細胞主要分布于中胚層與神經外胚層，但也能促進內胚層衍生物的有絲分裂。已知bFGF在很多報道中都作為胰島素分泌細胞的誘導劑使用，但其作用機制尚不明確。bFGF本身沒有信號肽，不能外分泌，通常在細胞死亡、細胞膜受到理化損傷時才被釋放到胞外［12］，或許在高糖培養(yǎng)基中添加bFGF可以模擬一種損傷的內環(huán)境來促使細胞增殖和分化。表皮生長因子是一種多功能的生長因子，在體內、體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。王越春等［6］發(fā)現，僅使用常規(guī)濃度的表皮生長因子和bFGF作為誘導分化劑，就可以使臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）在高糖培養(yǎng)基中較快地發(fā)生形態(tài)學變化，并且在細胞內和血清中都可以檢測到較高濃度的胰島素。雖然誘導而來的產胰島素細胞功能還不夠成熟，難以分泌足夠的胰島素，但此法初步顯示了其簡便、快速、高效和安全的特點。

乙胞素屬表皮生長因子家族，它在調節(jié)胰腺內分泌細胞前體的增殖和分化方面起著重要的作用［13］。有研究表明，乙胞素可促進β細胞前體的增殖及向β細胞分化［14］，而且乙胞素可以通過上調Pax4的表達來促進胰腺/胰島細胞的增殖、分化［15］。

另外，活化素A是轉化生長因子β超家族的一個成員，它能調節(jié)體內 β細胞的再生［13，16］。胰高血糖素樣肽及其類似物Extendin4，被認為具有刺激β細胞復制和導管細胞再生的能力［2］。轉化生長因子α能誘導β細胞增殖但不能誘導其分化;胰島素樣生長因子能促進導管細胞分化和胰島細胞增殖。

6 利用轉基因方法可以促進MSC分化為胰島β細胞

PDX1、BTC基因在MSC分化為胰島β細胞中起著重要的作用。PDX1可以調節(jié)大鼠骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC）分化為產胰島素細胞，Yuan等［17］通過胰島素釋放試驗發(fā)現，經過PDX1 cDNA轉染的MSC受到葡萄糖刺激后胰島素的分泌，通過雙硫腙染色可以看到胰島樣的結構被染成黑紅色，而PDX-1表達陰性的細胞受葡萄糖刺激后沒有胰島素的分泌，雙硫腙染色也看不到胰島樣的結構。Li等［18］的研究中MSC被攜帶大鼠PDX1和BTC基因的質粒轉染，結果顯示PDX-1與BTC同時表達顯著增加了MSC分化為巢陽性上皮樣前驅細胞和胰島樣球狀體的能力。同時表達PDX-1和BTC的MSC胰島素和GLUT-2 mRNA的表達顯著上升，并且可以在葡萄糖刺激后分泌胰島素和C肽。轉基因BTC比直接添加BTC要好，因為它能提高細胞與細胞之間的接觸。

Notch基因在MSC分化為胰島β細胞過程中亦發(fā)揮重要的作用。Hu等［19］的實驗中UCB-MSC被轉染表達Notch受體和配體的基因。與對照組相比，轉染后的細胞在分化過程中Notch信號的過度表達導致了胰島素基因、胰島素原、胰島素陽性細胞表達的下調。還有其他一些研究表明，Notch信號控制著胰腺的分化［20，21］，這些研究指出MSC分化為產胰島素細胞受Notch信號顯著影響，然而并不知道這些細胞是否表達Notch信號組分以及分化的具體機制。

7 結語

臨床上全胰移植以及胰島移植的成功證實了胰島β細胞替代療法的可行性，這使得1型糖尿病和全胰切除后的患者可以不再使用外源性胰島素［22］。MSC不存在倫理學問題，并且具有免疫調節(jié)優(yōu)勢，因此把MSC作為胰島β細胞的再生源具有較好的應用前景。影響MSC體外分化為胰島β細胞的因素錯綜復雜，但可以肯定的是細胞外微環(huán)境和內在的基因決定著MSC的命運。雖然MSC經誘導后可表達胰腺內分泌細胞的標記并能分泌胰島素，但對其分化機制尚未完全清楚，目前還不存在所謂的標準及完善的誘導方案，對誘導劑的使用劑量、濃度、使用時間、作用時間還需要進一步探索?，F在眾多研究培養(yǎng)出的胰島β細胞在動物體內尚不能很好地根據血糖的動態(tài)變化來發(fā)揮功能，正如使用外源性胰島素并不能模擬生理性胰島素的分泌。因此，還需更多地對體外影響MSC向胰島β細胞分化的因素進行研究，盡可能地模擬體內β細胞成熟的環(huán)境來獲得擁有完整功能的β細胞。

［1］Reyes M，Lund T，Lenvik T，et al.Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells［J］.Blood，2003，98（9）:2615-2625.

［2］Gao F，Wu DQ，HU YH，et al.Extracellular matrix gel is necessary for in vitro cultivation of insulin producing cells from human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells［J］.Chin Med J（Engl），2008，121（9）:811-818.

［3］Huang W，Zhu JZ，Miao ZN，et al.In vitro culture and influencing factors of mesenchymal stem cells derived from human umbilical blood［J］.J Clin Rehabil Tissue Engineer Res，2007，11（3）:572-575.

［4］Tang DQ，Cao LZ，Burkhardt BR，et al.In vivo and in vitro characterization of insulin-producing cells obtained from murine bone marrow［J］.Diabetes，2004，53（7）:1721-1732.

［5］Yang L，Li S，Hatch H，et al.In vitro trans-differentiation of adult hepatic stem cells into pancreatic endocrine hormone-producing cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（12）:8078-8083.

［6］王躍春，張洹，段阿林，等.單純生物學制劑誘導人臍帶間充質干細胞向胰島素分泌細胞快速分化［J］.生理學報，2010，62（1）:73-78.

［7］Chen LB，Jiang XB，Yang L.Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells［J］.World J Gastroenterol，2004，10（20）:3016-3020.

［8］Edlund H.Pancreatic organogenesis-developmental mechanisms and implications for therapy［J］.Nat Rev Genet，2002，3（7）:524-532.

［9］Chao KC，Chao KF，FU YS，et al.Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's Jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 Diabetes［J］.PLoS One，2008，3（1）:e1451.

［10］Neshati Z，Matin MM，Bahrami AR，et al.Differentiation of mesenchymal stem cells to insulin-producing cells and their impact on type 1 diabetic rats［J］.J Physiol Biochem，2010，66（2）:181-187.

［11］Wang YY，Hu T，Jia GL，et al.Effects of EGB on proliferation of human umbilical venous endothelial cells［J］.Fourth Mil Med Univ，2004，25（13）:1179-1181.

［12］Ray J，Baird A，Gage FH，et al.A 10-amino acid sequence of fibroblast growth factor 2 is sufficient for its mitogenic activity on neural progenitor cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（13）:7047-7052.

［13］Sun Y，Chen L，Hou WK，et al.Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from diabetic patients into insulinproducing cells in vitro［J］.Chin Med J，2007，120（9）:771-776.

［14］Li L，Yi Z，Seno M，et al.Activin A and betacellulin:effect on regeneration of pancreatic beta-cells in neonatal streptozotocin treated rats［J］.Diabetes，2004，53（3）:608-615.

［15］Brun T，Franklin I，St-Onge L，et al.The diabetes-linked transcription factor PAX4 promotes beta-cell proliferation and survival in rat and human islets［J］.J Cell Biol，2004，167（6）:1123-1135.

［16］Wu LF，Wang NN，Liu YS，et al.Differentiation of Wharton's jelly primitive stromal cells into insulin-producing cells in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Tissue Eng Part A，2009，15（10）:2865-2873.

［17］Yuan H，Li J，Xin N，et al.Expression of Pdx1 mediates differentiation from mesenchymal stem cells into insulin-producing cells［J］.Mol Biol Rep，2010，37（8）:4023-4031.

［18］Li L，Li F，Qi H，et al.Coexpression of pdx1 and betacellulin in mesenchymal stem cells could promote the differentiation of nestinpositive epithelium-like progenitors and pancreatic Islet-like spheroids［J］.Stem Cells Develop，2008，17（4）:815-824.

［19］Hu YH，Wu DQ，Gao F，et al.Notch signaling:a novel regulating differentiation mechanism of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into insulin-producing cells in vitro［J］.Chin Med J，2010，123（5）:606-614.

［20］Siveke JT，Lubeseder-Martellato C，Lee M，et al.Notch signaling is required for exocrine regeneration after acute pancreatitis［J］.Gastroenterology，2008，134（2）:544-555.

［21］Dror V，Nguyen V，Walia P，et al.Notch signalling suppresses apoptosis in adult human and mouse pancreatic islet cells［［J］.Diabetologia，2007，50（12）:2504-2515.

［22］Gangemi A，Salehi P，Hatipoqlu B，et al.Islet transplantation for brittle type 1 diabetes:the UIC protocol［J］.Am J Transplant，2008，8（6）:1250-1261.