影響電穿孔法轉化效率的因素

張小娟(綜述)，張榮光(審校)

(1.河南科技大學醫(yī)學院病原生物學教研室，河南洛陽471003;2.鄭州大學河南省分子醫(yī)學重點學科開放實驗室，鄭州450001)

電穿孔轉化細胞的方法是分子生物學中常用的技術，廣泛應用于基因克隆、外源基因的表達、基因定位、基因圖譜的繪制等研究［1-3］。雖然基因轉移可以通過化學的方法實現(xiàn)，但是操作復雜且效率低。經(jīng)典的氯化鈣轉化法轉化效率較低;病毒轉染的方法雖然效率很高，但是對健康的威脅不可忽視;電穿孔基因轉移法適用范圍廣，轉化效率高，殘余毒性小［4］，是最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N轉化方法。然而，由于影響電穿孔方法的因素較為復雜，其中一些技術環(huán)節(jié)的機制并不十分清楚，轉化效果的穩(wěn)定性難以保證，這在一定程度上制約了該方法的推廣應用。近年來，隨著國內(nèi)外對該方法應用實踐的增加，人類對影響電穿孔法轉化效率的因素有了更深入的認識?，F(xiàn)對影響電穿孔法轉化效率的因素進行綜述。

1 感受態(tài)細胞

1.1 細菌濃度 李南等［5］在優(yōu)化大腸埃希菌TG1電轉化條件時，將細菌懸液按1∶10梯度稀釋，取等體積不同濃度的菌液進行電穿孔。結果發(fā)現(xiàn)，在一定規(guī)范內(nèi)，細菌濃度越高，轉化效率就越高，兩者呈正相關，菌濃度為1010個/mL時，轉化效率最高。韋曉明等［6］在探索大腸埃希菌XL1-Blue菌株電轉化條件時，分別用2.5×1013、2.5×1014、2.5×1015個/L三個感受態(tài)濃度進行電轉化，結果表明菌濃度為2.5× 1015個/L時的轉化效率較菌濃度為2.5×1014個/L時高10倍，較2.5×1013個/L高16倍。

1.2 細菌生長周期 細菌培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉化，但最好的轉化效率是在對數(shù)生長期。電轉化效率和細胞存活數(shù)均與轉化前的細胞所處生長階段有關。在對數(shù)生長期，每個細胞對電擊都非常敏感，死亡率較高。但在存活的細胞中，轉化子的比例較高(約80%)。

當細胞進入對數(shù)后期，細胞存活率上升，轉化效率也逐漸下降，因此電轉化的細菌以培養(yǎng)到對數(shù)中期較為合適［7，8］。在制備感受態(tài)時，常通過測定菌液光密度(optical density，OD)值方法判斷細菌生長階段。韋曉明等［6］發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌XL1-Blue處于對數(shù)生長早期、OD600為0.3～0.4時轉化效率達到最高，隨著細菌的老化，OD600值每增加0.1，轉化效率都會下降一個數(shù)量級以上。所以制備電轉化用感受態(tài)時，應嚴格掌握菌液的OD值，以保持較高的轉化效率。

1.3 細胞培養(yǎng)溫度 韓峰等［9］采用大腸埃希菌DH5α菌株研究了細菌培養(yǎng)溫度對電轉化效率的影響。研究結果顯示，在18℃下培養(yǎng)的細菌，當菌液OD600為0.5～1.0時，轉化效率都維持在高水平;而在37℃培養(yǎng)的細菌，僅當OD600為0.6～0.7時轉化效率出現(xiàn)一個銳利的峰值，菌液OD值偏高或偏低都會使轉化效率顯著下降。

2 電轉化過程

2.1 電場強度 電場強度是影響電轉化效率的主要因素。在一定范圍內(nèi)，隨著電場強度的增加，外源DNA越容易進入細胞，但細胞的死亡率也會隨著電場強度的增加而增加。所以要得到最高的電轉化效率，一方面要提高電場強度到一個合適數(shù)值，另一方面又要盡量降低死亡率。戴建新等［10］研究了電場強度對電轉化效率的影響。結果表明在低電場強度(1～10 kV/cm)作用下，轉化效率＜109CFU/μg DNA;而當電場強度＞10 kV/cm時，轉化效率顯著上升，并在12.5～15 kV/cm時，轉化效率達到峰值(約2× 109CFU/μg);當電場強度繼續(xù)升高時，轉化效率則迅速下降。

2.2 脈沖時間 研究表明，電脈沖時間對電轉化效率有較大影響，時間太短或太長均會使轉化效率降低。目前，脈沖時程閾值現(xiàn)象還不能作出理論計算，但其合理的解釋為:一方面，因為膜電容的充電需要一定的時程，才能使膜電位達到穩(wěn)定值，這一時程正好是電穿孔導入小分子的閾值;另一方面，只有外電場持續(xù)提供能量，保持胞膜穿孔部位局部的無序狀態(tài)，才能使孔道擴大至細胞骨架網(wǎng)孔的大小。如果脈沖時程過短，則孔道很快自發(fā)地復原為有序結構。這可能是采用電穿孔方法導入大分子DNA時，脈沖時程存在閾值的原因。戴建新等［10］在探索大腸埃希菌DH5α電轉化影響因素時發(fā)現(xiàn)，當電場強度為15 kV/cm時，脈沖持續(xù)時間取4～5 ms，其轉化效率即達峰值;若脈沖持續(xù)時間延長，則轉化效率迅速下降。

2.3 電擊前后冰浴時間 在進行電轉化前，通常不需要把DNA提前加到細胞懸液中。據(jù)報道，DNA在進入細胞之前并不需要結合到細胞表面［7，8］，而且在菌液中預先加入的DNA還有可能被感受態(tài)細胞分泌的核酸酶的降解。張洋等［11］采用大腸埃希菌DH10B研究了轉化前的冰浴時間對轉化效率的影響。結果發(fā)現(xiàn)，冰浴時間0～30 min對轉化效率無顯著影響，即DNA分子與細胞表面的結合(或充分靠近)并不是必需的，也可能混合完全后的質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細胞已經(jīng)完成了結合過程(或距離已經(jīng)充分接近)。韓峰等［9］也證實電擊前將感受態(tài)細胞在冰上靜置0～30 min對轉化效率影響不大，在最初的5 min內(nèi)轉化效率稍有提高，但隨后的25 min內(nèi)則呈下降趨勢。電擊后在加入培養(yǎng)基前的冰浴時間不同(0～30 min)，對轉化效率影響顯著，在冰浴1 min內(nèi)轉化效率就呈現(xiàn)大幅度下降，10 min后幾乎降至最低點，只有不冰浴的20%。

2.4 脈沖信號持續(xù)時間 電脈沖信號音響后持續(xù)不同時間對轉化效率有較大影響。張建瓊等［12］的實驗結果表明，電脈沖音響后持續(xù)2 s較信號音響后即停和信號音響后持續(xù)3 s轉化效率明顯增加。

2.5 樣品鹽離子成分 如果樣品中鹽離子濃度過高時，導電能力增強，放電兩極之間形成低電阻通路，瞬間電流急劇增加，產(chǎn)生無效放電或旁路放電，不能使菌體胞膜產(chǎn)生孔洞，同時，瞬間強電流導致電擊體系溫度驟然升高，大量細菌死亡，引起轉化效率顯著下降，甚至引起電擊穿現(xiàn)象，造成實驗失敗。方勤等［13］研究發(fā)現(xiàn)，采用乙醇沉淀法可有效去除連接產(chǎn)物中的鹽分，有利于提高轉化效率。然而，包其郁等［14］對1 μL各含0.01 ng或0.001 ng pUC18 DNA的1×連接反應混合物進行乙醇沉淀處理后，轉化效率反而降低至1/10～1/100，因此認為乙醇沉淀法不能有效地提高轉化效率。在微量DNA狀態(tài)時，由于處理過程中造成DNA的丟失反而使轉化效率降低。此外，稀釋法、透析法也能有效降低樣品鹽離子濃度，但稀釋法不利于小體積轉化的要求;透析法回收率較低。因此，急需研究開發(fā)一種純化回收微量質(zhì)粒DNA的簡便而有效的方法。

2.6 抗生素濃度 李南等［5］在用質(zhì)粒pFab74X電轉化大腸埃希菌TG1時發(fā)現(xiàn)，將選擇培養(yǎng)基中氨芐青霉素的濃度從100 mg/L降至20 mg/L，可使轉化效率上升約5倍。其可能原因是電穿孔后的細胞雖然經(jīng)過短時間的恢復培養(yǎng)，但仍然比較脆弱，適當降低選擇性培養(yǎng)基中抗生素濃度，有利于轉化菌的抗性基因的充分表達，可以進一步提高轉化效率。韋曉明等［6］在探索大腸埃希菌XL1-Blue電轉化條件時，分別用含氨芐青霉素100、50、20 mg/L的培養(yǎng)板篩選轉化菌，結果表明，氨芐青霉素濃度為100 mg/L時的轉化率是50 mg/L時的1/2，是20 mg/L時的1/3。

2.7 電擊溫度 電擊時產(chǎn)熱可直接影響感受態(tài)細胞的存活率，因此需要特別注意保持菌液的溫度。電轉化時樣品的開始溫度對轉化效率影響很大，如大腸埃希菌在0～4℃進行電擊的轉化效率比在室溫下至少提高100倍［8］。

3 質(zhì)粒大小、用量及構象

3.1 質(zhì)粒大小 質(zhì)粒的大小直接影響轉化效率。由于需要導入細菌的質(zhì)粒長度遠大于電穿孔所導致的細胞空洞，因此質(zhì)粒只能沿長軸方向通過擴散導入細胞。短質(zhì)粒較之長質(zhì)粒轉化率高的原因為:電擊后，在細胞孔道重新閉合前的數(shù)秒內(nèi)，短質(zhì)粒完全進入細胞的數(shù)目較長質(zhì)粒多，進而形成較多的轉化菌落;而長質(zhì)粒來不及完全進入菌體細胞內(nèi)，致使獲得的轉化菌落較少［15］。

3.2 質(zhì)粒用量 電轉化時的質(zhì)粒DNA用量在很大范圍內(nèi)和轉化子數(shù)呈線形關系。研究表明，電轉化大腸埃希菌時，質(zhì)粒DNA用量在10～7.5 mg/L范圍內(nèi)，轉化子數(shù)和DNA用量呈線型關系，轉化效率可達109個/μg DNA以上［8］。但在相同的轉化體積中(細胞數(shù)相同)DNA用量愈多，轉化子數(shù)也愈多，即轉化效率(轉化子數(shù)/存活細胞數(shù))和DNA濃度呈正相關。

3.3 質(zhì)粒構象 質(zhì)粒DNA的構象對轉化效率的影響非常明顯，超螺旋質(zhì)粒的轉化效率遠高于線型和開環(huán)質(zhì)粒，因此用于轉化的質(zhì)粒中超螺旋狀態(tài)DNA分子的比例至少應達到2/3［16］。

文獻報道的不同菌株電轉化條件不統(tǒng)一，由于菌株細胞壁厚薄、細胞大小及形狀等因素影響造成菌株對電轉化的耐受性及敏感程度不同，其在電轉化時所采用的條件也各不相同。因此，在對新菌株進行電穿孔轉化時，有必要探索其最佳轉化條件。

4 小結

目前電穿孔技術的應用范圍得到不斷拓展，例如，將該技術用于核酸疫苗的轉遞［17，18］;通過質(zhì)?；蛲鈦砘蜣D染原生動物［19］;非熱效應殺滅腫瘤細胞［20］;向正常組織或腫瘤組織中轉入治療性蛋白基因［21，22］;向組織中轉入生長因子基因，促進組織再生［23］;基因剔除［24］等。隨著國內(nèi)外對電穿孔技術的研究日益深入，其在生物和醫(yī)學領域?qū)⒂兄浅V闊的應用前景。

［1］ Zaharoff DA，Henshaw JW，Mossop B，et al.Mechanistic analysis of electroporation-induced cellular uptake of macromolecules［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2008，233(1):94-105.

［2］ Valero A，Post JN，van Nieuwkasteele JW，et al.Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device［J］.Lab Chip，2008，8(1):62-67.

［3］ Wang Y，Zhang S.High frequency transformation of the industrial erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea［J］.Biotechnol Lett，2008，30(2):357-361.

［4］ 唐巖，唐軍民，戰(zhàn)軍，等.樹突狀細胞電轉染的優(yōu)化條件及影響因素［J］.解剖學報，2007，38(2):209-212.

［5］ 李南，凌世淦.電穿孔法轉化大腸桿菌TG1的條件優(yōu)化［J］.藥物生物技術，2001，8(3):143-146.

［6］ 韋曉明，蘇明權，楊安鋼，等.電轉化條件對大腸桿菌XL1-Blue菌株轉化效率的影響［J］.生物技術通訊，2003，14(6): 566-568.

［7］ Calvin NM，Hanawalt PC.High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation［J］.J Bacteriol，1988，170(6): 2796-2801.

［8］ Dower WJ，Miller JF，Ragsdale CW.High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation［J］.Nucleic Acids Res，1988，16(13):6127-6146.

［9］ 韓峰，褚艷，于文功.低溫培養(yǎng)對大腸桿菌電穿孔轉化效率的影響［J］.高技術通訊，2003，13(9):30-34.

［10］ 戴建新，周鳳鵑.電穿孔法轉化大腸桿菌的影響因素［J］.第二軍醫(yī)大學學報，1999，20(5):340.

［11］ 張洋，王志強，劉斌，等.DH10B菌株高效電轉化條件探究［J］.生物工程學報，2007，23(2):347-351.

［12］ 張建瓊，謝維.高效電轉化率條件的探索［J］.南京師大學報:自然科學版，2000，23(2):72-75.

［13］ 方勤，田靜.電轉化法提高平連載體 DNA轉化效率的研究［J］.生物技術，1999，9(4):5-8.

［14］ 包其郁，孫永巧，王慧峰，等.影響電轉化效率的幾個因素探討［J］.溫州醫(yī)學院學報，2003，33(1):9-11.

［15］ 汪和睦，李金慧.細胞電穿孔導DNA的動態(tài)特征［J］.微生物學通報，1994，21(2):67-71.

［16］ 路艷艷，皇甫永穆.電穿孔法對分枝桿菌進行高效基因轉化［J］.北京醫(yī)科大學學報，2000，32(2):178-181.

［17］ Luxembourg A，Evans CF，Hannaman D.Electroporation-based DNA immunisation:translation to the clinic［J］.Expert Opin Biol Ther，2007，7(11):1647-1664.

［18］ Leblanc R，Vasquez Y，Hannaman D，et al.Markedly enhanced immunogenicity of a Pfs25 DNA-based malaria transmission-blocking vaccine by in vivo electroporation［J］.Vaccine，2008，26(2): 185-192.

［19］ Fernandez-Robledo JA，Lin Z，Vasta GR.Transfection of the protozoan parasite Perkinsus marinus［J］.Mol Biochem Parasitol，2008，157(1):44-53.

［20］ Al-Sakere B，Andre F，Bernat C，et al.Tumor ablation with irreversible electroporation［J］.PLoS ONE，2007，2(11):e1135.

［21］ Cemazar M，Sersa G.Electrotransfer of therapeutic molecules into tissues［J］.Curr Opin Mol Ther，2007，9(6):554-562.

［22］ Van Tendeloo VF，Ponsaerts P，Berneman ZN.mRNA-based gene transfer as a tool for gene and cell therapy［J］.Curr Opin Mol T-her，2007，9(5):423-431.

［23］ Kumar A，Godwin JW，Gates PB，et al.Molecular basis for the nerve dependence of limb regeneration in an adult vertebrate［J］.Science，2007，318(5851):772-777.

［24］ Cregg JM.DNA-mediated transformation［J］.Methods Mol Biol，2007(389):27-42.