劉書東 王娟娟 陳根元 李蓮瑞*

(1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

(2 塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

葉爾羌高原鰍［triplophysa(Hedinichthys)yarkandensis(Day)］為鰍科、高原鰍屬、鼓鰾亞屬的魚類，俗名葉爾羌條鰍、狗頭魚［1，2］。主要分布新疆南部的塔里木河水系，但近年來，由于環(huán)境污染、病害頻繁，造成了資源的缺乏，成為瀕危魚類。對葉爾羌高原鰍病害的防治，除了保護好當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，還可以提高魚本身的免疫能力。在病害早期，魚類主要依靠非特異性體液免疫來抵御病原體感染，而在此過程中抗菌肽起到一定的重要作用。(Antibacterial peptides)是一類由基因編碼的小分子多肽，是機體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的重要組成部分，生物體產(chǎn)生的對抗外源性病原體侵襲致病作用的防御性肽類活性物質(zhì)，一般由10～50個氨基酸組成［3］?？咕姆肿恿啃。钚詮?，功能廣泛，應(yīng)用基因工程克隆與表達抗菌肽基因，改造合成抗菌肽基因以及動物的轉(zhuǎn)抗菌肽基因工程等已越來越受到人們的重視。Hepcidin作為魚類抗菌肽的一種類型備受關(guān)注，是一種有肝臟特異表達的抗菌肽，相對分子質(zhì)量小(4 kD左右)，具有顯著的廣譜抗菌活性，是機體天然免疫的一種效應(yīng)子，也是調(diào)節(jié)鐵代謝的重要分子，目前被認為是調(diào)節(jié)維持鐵穩(wěn)態(tài)極其重要的負激素［4］。降落PCR(touchdown PCR，TD—PCR)是一種設(shè)計多循環(huán)以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低，從而達到最佳擴增條件的方法。本實驗利用降落式PCR技術(shù)擴增葉爾羌高原鰍抗菌肽基因特定片段，獲得良好效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:

葉爾羌高原鰍(Triplophysa(Hedinichthys)yarkandensis(Day))試驗用魚，系塔里木河流域阿拉爾河段，人工小抬網(wǎng)和地籠捕撈而得。

1.1.2 儀器與試劑:電泳儀DYY－12穩(wěn)壓電泳儀、TC－512型PCR儀、凝膠成像儀;PCR擴增所用的主要試劑dNTPs、TaqDNA酶、DL 2000 Marker購自TakaRa、超純凈水;瓊脂糖由北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取:

本研究參照徐麗君等提取葉爾羌高原鰍肝胰臟總RNA的方法進行提取［5］。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳

采用分子克?。?］方法進行。

1.2.3 第一條鏈合成

取 RNA8 μL，dNTP 1 μL ，OligdT 1 μL 65 ℃，5 min，冰上1～2 min;在分別加入5×Primesoript buffer 4 μL，RNA Inhibiter 0.5 μL，Primer script RTase1 μL，PCR H2O，混勻，42 ℃ 45 min，70 ℃ 15 min，冰浴。

1.2.4 引物設(shè)計

根據(jù) GenBank上已報道的魚類Hepcidin基因序列設(shè)計引物:

PF:5'－ggcGAATTCATGAAGACATCAGTGTTTGCTG－3'

PR:5'－ggcCTCGAGTAGTGGTCACAGGACCCGTCA－3'

引物由北京華大中生科技發(fā)展有限公司合成，引物PF和PR用無RNA酶水稀釋成20 pmol/μL的工作濃度備用。

1.2.5 普通PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序:

普通PCR反應(yīng)體系(20 μL)及反應(yīng)程序:PCR反應(yīng)體系:dNTP 2 μL，d3H2O 12.5 μL，10 × Buffer 2 μL， PF0.5 μL， PR0.5 μL， DNA 1 μL，Taq 0.4 μL。

反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性l min;59.5℃退火30 s;72℃延伸l min進行32個循環(huán);72℃延伸10 min。

PCR擴增結(jié)束，取5 μL擴增產(chǎn)物于l%瓊脂糖凝膠，100 V電泳20 min，用VP凝膠成像系統(tǒng)觀察并成像分析。

1.2.6 降落PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序:

PCR 反應(yīng)體系:dNTP 2 μL，d3H2O 12.5 μL，10 × Buffer 2 μL，PF 0.5 μL，PR 0.5 μL，DNA 1 μL，Taq 0.4 μL;PCR 擴增程序:94℃ 5 min;94℃30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，62℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2次循環(huán);94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2次循環(huán);94℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94 ℃30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃90 s，2 次循環(huán);94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2次循環(huán);94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，2 次循環(huán);94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，26次循環(huán);72 ℃10 min。PCR擴增結(jié)束，取5 μL擴增產(chǎn)物于l%瓊脂糖凝膠，100 V電泳20 min，用UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察并成像分析。

1.2.7 膠回收

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的瓊脂糖回收試劑盒回收目的基因片段，回收方法按試劑盒提供的方法。

1.2.8 葉爾羌高原鰍降落式 PCR基因片段與pMD18－T載體連接

回收的RT－PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體于1.5 mL離心管中。于16℃連接過夜。

1.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

從－70℃取出感受態(tài)克隆細胞DH5α后放置冰水中5 min使之融化，加入連接產(chǎn)物，混勻。冰浴30 min;42℃熱沖擊90 s，冰浴2 min;加入LB液體培養(yǎng)基500 μL，37 ℃水浴10 min，后于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)50 min。取100 μL轉(zhuǎn)化菌混勻后涂LB Amp+(50 mg/mL)平板，將Amp+板置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

1.2.10 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的培養(yǎng)

將轉(zhuǎn)化的單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp+50 mg/ml)中，于37℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)10 h。

1.2.11 轉(zhuǎn)化菌的PCR鑒定

反應(yīng)條件:90℃預(yù)變性5 min后進行循環(huán)，包括95 ℃、50 s，55 ℃、50 s，72 ℃、50 s，30 個循環(huán)后，72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析:

獲得的總RNA中，28S和18S帶型整齊，基本不拖尾，而且28S rRNA帶的亮度明顯高于18S rRNA，無降解，說明RNA完整性好(圖1)。經(jīng)過降落式PCR目的基因在387 bp，大小與預(yù)期的結(jié)果基本一致(圖2)，而普通PCR并沒有特異性條帶(圖3)。測序后在與加州鱸魚、小口黑鱸抗菌肽Hepcidin同源性達90%以上，在抗菌肽Hepcidin成熟肽有八個半胱氨酸，與已報道的抗菌肽一致(圖4)。通過MEGA4.1構(gòu)建進化樹，可以看出葉爾羌高原鰍與黑棘鯛在抗菌肽Hepcidin基因親緣關(guān)系最近(圖5)。

圖1 葉爾羌高原鰍肝胰臟總RNA

圖2 降落式PCR擴增抗菌肽Hepcidin基因

圖3 普通式PCR擴增抗菌肽Hepcidin基因

圖4 葉爾羌高原鰍Hepeidin抗菌肽序列及其編碼的氨基酸序列

圖5 葉爾羌高原鰍Hepeidin抗菌肽基因進化樹

3 討論

抗菌肽Hepcidi是一類由基因編碼的小分子多肽，是機體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的重要組成部分，生物體產(chǎn)生的對抗外源性病原體侵襲致病作用的防御性肽類活性物質(zhì)?？咕姆肿恿啃?，活性強，功能廣泛。其殺菌過程為抗菌肽分子α－螺旋上的正電荷與細菌質(zhì)膜磷脂分子上的負電荷在靜電力作用下，相互吸引而靠近;然后借助于分子中N端與C端間的柔性，抗菌肽分子中的疏水端插入質(zhì)膜中;隨后，α－螺旋也插入質(zhì)膜中，這樣就破壞了脂質(zhì)雙分子層原有的有序結(jié)構(gòu)，由于β－折疊的兩親性使抗菌肽分子通過膜內(nèi)分子間的位移而相互聚集在一起，從而在膜上形成離子通道，細菌最終不能保持正常滲透壓而致死［7，8］。

魚類抗菌肽基因工程方面的報道主要集中在對hepcidin的研究，肝臟是Hepcidin的主要合成場所，脊髓、心臟、肺也有少量的表達，但睪丸、卵巢、前列腺、膀胱、結(jié)腸和小腸幾乎沒有表達［9，10］。

本試驗將退火溫度范圍設(shè)定為63℃至55℃，主要是為了提高特異性引物與非特異性在該循環(huán)范圍內(nèi)出現(xiàn)的明顯程度。對于低于退火溫度的范圍也會有非特異性，但不明顯［11］。不過與特異性擴增的目的基因相比是微不足道。本實驗經(jīng)過普通PCR擴增Hepcidin基因重復(fù)多次末見特異性條帶，而利用TD－PCR法成功地擴增出了該基因，大小與預(yù)期結(jié)果及前人的論述一致［12］。

從抗菌肽Hepcidin基因來看普通PCR和TDPCR，前者的優(yōu)點是:程序省時，簡單，一般的PCR儀都可完成，缺點是:退火溫度不適當(dāng)時容易出現(xiàn)假陽性或結(jié)果不明顯;而TD－PCR程序雖然復(fù)雜，但能非常有效地降低或避免假陽性，且在不理想的工作條件下也可擴增出特異性產(chǎn)物，可用于普通PCR難以擴增的基因片段［13］。

通過GenBank數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)葉爾羌高原鰍抗菌肽hepcidin基因與黑棘鯛、小口黑鱸同源性達90%，在進化樹可以看出黑棘鯛親緣性最近。從而證明了，降落式PCR可用于普通PCR難以擴增的基因片段。

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