韓咪莎 林 珊 高學(xué)勇＊

環(huán)磷酰胺對(duì)雄性大鼠生殖免疫功能的影響

韓咪莎1林 珊2高學(xué)勇1＊

（1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與組胚學(xué)系 福州350004；2福州兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科 福建350003）

目的 觀察環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠睪丸及其細(xì)胞免疫的影響，探討抗腫瘤藥物在生殖免疫功能中的機(jī)制。方法 選用16只15周齡SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只；實(shí)驗(yàn)組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg／kg／d，連續(xù)5天，用藥兩個(gè)月后，應(yīng)用HE染色法研究大鼠睪丸遠(yuǎn)期組織學(xué)變化，用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL方法）檢測(cè)生精小管中生殖細(xì)胞凋亡，放射免疫法檢測(cè)血清睪酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH），流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行血液T淋巴細(xì)胞亞群分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組睪丸生精小管直徑縮小、間距增寬、生精上皮變薄、生殖細(xì)胞層次和數(shù)量減少、生精小管腔多未見精子形成，實(shí)驗(yàn)組睪丸生精小管直徑、面積、生殖細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較生殖細(xì)胞凋亡增多，差異顯著（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較血清T明顯降低，差異顯著（P＜0.01），血清FSH、LH水平兩組間差異無顯著性；血液T淋巴細(xì)胞亞群分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較CD3＋CD4＋、CD4＋／CD8＋明顯降低（P＜0.01），CD3＋CD8＋明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠睪丸遠(yuǎn)期損害明顯，促進(jìn)生殖細(xì)胞凋亡，降低睪酮的分泌，并抑制T淋巴細(xì)胞的免疫功能。

環(huán)磷酰胺；生殖細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；T淋巴細(xì)胞

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是常用抗腫瘤藥物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，給予大鼠一次性環(huán)磷酰胺腹腔注射，劑量在75mg／kg以上可造成大鼠明顯的生育力損害［1］，對(duì)男性生殖系統(tǒng)的損傷和對(duì)后代的潛在致畸危險(xiǎn)，已經(jīng)引起醫(yī)患雙方的高度關(guān)注［2］。環(huán)磷酰胺對(duì)FSH、LH、T的影響時(shí)有報(bào)道。由于的使用劑量、時(shí)間、方式等不同，環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，有所不同。本研究采用成年大鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺處理，較長時(shí)間后，觀察大鼠睪丸結(jié)構(gòu)變化，初步探討環(huán)磷酰胺對(duì)精子發(fā)生、性激素及T淋巴細(xì)胞變化的影響。

材料和方法

1.材料及主要試劑

清潔級(jí)雄性SD大鼠16只，15周齡，體重300-350克，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；凋亡檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒分別購于武漢博士德生物工程有限公司、福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；FSH、LH、T含量放射免疫試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；小鼠抗大鼠 CD4FITC、CD8PE、CD3Per-CP熒光標(biāo)記單克隆抗體試劑盒購自BD公司。

2.方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只；模擬環(huán)磷酰胺臨床沖擊治療用藥劑量換算成大鼠總用藥劑量100mg／kg［3］，實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射給藥，環(huán)磷酰胺20mg／kg／d，連續(xù)5d［4］，對(duì)照組注射等量生理鹽水。

2.2 取材及標(biāo)本制作

用藥后兩個(gè)月，以3%戊巴比妥鈉（30mg／kg）麻醉，剖胸抽取右心房血液，取2ml血液離心取血清，低溫冰箱保存，待測(cè)睪酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）；取1ml新鮮全血注入含EDTA抗凝試管中，用于流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析；打開腹腔，左側(cè)睪丸注射4%多聚甲醛0.5ml，預(yù)固定30min后，再固定24h；睪丸常規(guī)石蠟包埋，制備5μm厚的連續(xù)切片，用于HE染色和生殖細(xì)胞凋亡的觀察。

2.3 各指標(biāo)檢測(cè)和觀察

2.3.1 睪丸組織HE染色和生殖細(xì)胞凋亡的觀察

取各組每只大鼠睪丸組織切片各2張，其中1張做HE染色，觀察睪丸組織學(xué)變化：生精小管面積、直徑、生殖細(xì)胞數(shù)量層次、及生精小管是否含精子，同時(shí)應(yīng)用顯微攝影系統(tǒng)PM-OBAD，進(jìn)行圖像分析自動(dòng)測(cè)量生精小管直徑、面積；另1張應(yīng)用TUNEL方法觀察生殖細(xì)胞凋亡，具體操作按凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行 ，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)各視野陽性細(xì)胞數(shù)；陰性對(duì)照不加末端轉(zhuǎn)化酶，以試劑盒提供的陽性對(duì)照切片作為陽性對(duì)照。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。按凋亡檢測(cè)試劑盒說明書（TUNEL方法）檢測(cè)生殖細(xì)胞凋亡。

2.3.2 檢測(cè)睪酮（T）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）

（1）血清睪酮檢測(cè)

取聚苯乙烯試管若干，編號(hào)后按試劑盒使用說明書中加樣順序表進(jìn)行加樣，加樣前所有試劑搖勻、并平衡至室溫。采用電腦放射免疫法程序的四參數(shù)回歸自動(dòng)處理得出結(jié)果。

（2）血清卵泡刺激素（FSH）檢測(cè)

取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號(hào)筆編號(hào)NSB、S0-S6和待測(cè)樣品管等，加樣前所有試劑搖勻、并平衡至室溫，后用微量取樣器按說明書中操作程序表加樣。采用電腦放射免疫法程序的四參數(shù)回歸自動(dòng)處理得出結(jié)果。

（3）血清黃體生成素（LH）檢測(cè)

取圓底聚苯乙烯試管若干，用記號(hào)筆編號(hào)NSB、S0-S6和待測(cè)樣品管等，加樣前所有試劑搖勻、并平衡至室溫，后用微量取樣器按說明書中操作程序表加樣。采用電腦放射免疫法程序的四參數(shù)回歸自動(dòng)處理得出結(jié)果。

2.3.3 血液中T淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

各取CD4FITC、CD8PE、CD3PerCP熒光標(biāo)記單克隆抗體試劑10μl和50μlEDTA抗凝全血置于Falcon試管中，同型對(duì)照，CD3-SSC設(shè)門（Gating），CD3PerCP特異分析 T淋巴細(xì)胞，CD4 FITC分析CD3＋CD4＋（Helper T cell，Th）占 T淋巴細(xì)胞百分率，CD8PE分析CD3＋CD8＋（Suppressor T cell，Ts）占 T淋巴細(xì)胞百分率。

2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS（edition 10.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）示，計(jì)量資料用方差分析，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)間差別用P值表示，P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況及睪丸HE染色切片觀察

用藥后，實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)了體重減輕，活動(dòng)減少，毛發(fā)發(fā)黃干枯無光澤，睪丸縮小。HE染色組織切片，對(duì)照組睪丸生精小管直徑寬，排列密集，生精上皮厚，生殖細(xì)胞層次和數(shù)量多，生精小管腔均見精子形成（圖1），實(shí)驗(yàn)組睪丸生精小管直徑縮小，間距增寬，生精上皮變薄，生殖細(xì)胞層次和數(shù)量減少，生精小管腔多未見精子形成（圖2），對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組生精小管直徑、面積、生殖細(xì)胞數(shù)見表1。

2.睪丸生殖細(xì)胞凋亡的觀察

對(duì)照組（圖3）生殖細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯少于實(shí)驗(yàn)組（圖4），對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組生殖細(xì)胞凋亡數(shù)見表2。

圖1 對(duì)照組睪丸生精小管直徑寬，生精上皮厚，生殖細(xì)胞數(shù)量多，精子多（HE染色 ×100）。圖2實(shí)驗(yàn)組睪丸生精小管直徑小，生精上皮薄，生殖細(xì)胞數(shù)量少，精子少（HE染色 ×100）。圖3對(duì)照組睪丸生精小管凋亡細(xì)胞少 （TUNEL方法 ×200）。圖4實(shí)驗(yàn)組睪丸生精小管凋亡細(xì)胞多 （TUNEL方法 ×200）。Fig.1 Testis of control group：Seminiferous tubule diameter widening，seminiferous epithelium thickened，the number of germ cells increased，sperm was found in seminiferous tubules.HE staining× 100Fig.2 Testis of experimental group：Seminiferous tubule diameter narrowed，seminiferous epithelium thinning，the number of germ cells decreased，sperm was not found in seminiferous tubules.HE staining × 100Fig.3 Testis of control group：Less testicular germ cell apoptosis.TUNEL method ×200Fig.4 Testis of experimental group：Increased germ cell apoptosis.TUNEL method×200

表1 各組睪丸生精小管直徑、面積、生殖細(xì)胞數(shù)、生殖細(xì)胞凋亡數(shù)（ˉx±s）Table 1 Testes seminiferous tubule diameter，area，the number of germ cells，the number of germ cell apoptosis（ˉx±s）of each group

3.血清睪酮（T）、卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較血清T明顯降低，變化顯著（P＜0.01）；血清FSH、LH水平兩組間差異無顯著性，見表2。

表2 各組大鼠血清T、FSH、LH水平（ˉx±s）Table 2 Serum T，F(xiàn)SH，LH levels（ˉx±s）in each group

4.血液T淋巴細(xì)胞亞群分析

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較 CD3＋CD4＋、CD4＋／CD8＋明顯降低（P＜0.01），CD3＋CD8＋明顯升高（P＜0.01）（圖5、6）。血液 T淋巴細(xì)胞亞群分析見表3。

表3 各組血液T淋巴細(xì)胞亞群分析（ˉx±s）Table 3 Analysis of blood T-lymphocyte subsets（ˉx±s）in each group

圖5 對(duì)照組血液T淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)分析圖CD3＋CD4＋占T淋巴細(xì)胞65.2%，CD3＋CD8＋占 T淋巴細(xì)胞30.3%，CD4＋／CD8＋ ：2.2Fig.5 Control group，blood T-lymphocyte subsets analyzed by flow cytometryCD3＋ CD4＋／total T lymphocytes 65.2%，CD3＋ CD8＋／total T lymphocytes 30.3%，CD4＋／CD8＋ ：2.2

圖6 實(shí)驗(yàn)組血液T淋巴細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)分析圖CD3＋CD4＋占 T 淋巴細(xì)胞50.0%，明顯下降；CD3＋CD8＋占T淋巴細(xì)胞47.1%，明顯升高 ，CD4＋／CD8＋：1.1，明顯下降。Fig.6 Experimental group，the blood T-lymphocyte subsets analyzed by flow cytometryCD3＋ CD4＋ total T lymphocytes 50.0%，significantly decreased；CD3＋ CD8＋total T lymphocytes 47.1%，significantly higher，CD4＋／CD8＋：1.1，decreased significantly.

討 論

睪丸是產(chǎn)生精子和分泌睪酮的重要器官，既受神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，包括性腺軸，也受到睪丸自身分泌的各種細(xì)胞因子的調(diào)控；生精小管是精子發(fā)生的部位 .生精小管上皮的生殖細(xì)胞由生精細(xì)胞和支持細(xì)胞（Sertoli細(xì)胞）構(gòu)成，其中生精細(xì)胞占絕大部分。從本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后兩個(gè)月，大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡明顯增多、生精小管萎縮、生精上皮變薄、生殖細(xì)胞數(shù)量減少、多未見精子形成，表明經(jīng)一個(gè)生殖周期后，睪丸組織仍表現(xiàn)明顯生精障礙。

我們認(rèn)為環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)睪丸生精障礙的機(jī)制主要通過以下途徑：（1）環(huán)磷酰胺損傷生殖細(xì)胞遺傳物質(zhì)，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡，環(huán)磷酰胺在急性期主要誘導(dǎo)有絲分裂活躍階段的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)理是通過激活c-Kit、p53及Fas／FasL等生殖細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控信號(hào)［5］。（2）干擾A型精原細(xì)胞自我更新增殖及分化功能，國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［6］在環(huán)磷酰胺的毒性作用下，可導(dǎo)致大鼠睪丸組織中膜型干細(xì)胞因子（SCFm）表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響增殖指數(shù)降低。有研究者從組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)［7］，在相鄰Sertoli細(xì)胞基底部和萎縮的基底層有的單個(gè)A型精原細(xì)胞殘存，其自我更新能力是有限的，其精子發(fā)生很難恢復(fù)到正常水平。（3）環(huán)磷酰胺損傷精子發(fā)生微環(huán)境，對(duì)于精子發(fā)生的微環(huán)境損傷機(jī)理，除了生精小管細(xì)胞層數(shù)減少，結(jié)構(gòu)紊亂等組織學(xué)研究外，分布紊亂或斷裂，致使Sertoli細(xì)胞形態(tài)變化，生殖細(xì)胞脫落，精子發(fā)生障礙。

本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組血清睪酮水平顯著降低，各組血清FSH、LH水平無顯著改變，與章振保等研究結(jié)果相似［8］；睪丸Leydig細(xì)胞產(chǎn)生睪酮，并通過垂體-睪丸軸反饋調(diào)控影響垂體LH產(chǎn)生，環(huán)磷酰胺對(duì)Leydig損傷，導(dǎo)致血清睪酮水平下降，睪酮下降通過垂體-性腺軸負(fù)反饋調(diào)控致LH升高；睪丸Sertoli細(xì)胞產(chǎn)生抑制素B，抑制素B的變化通過垂體-睪丸軸反饋調(diào)節(jié)FSH變化，當(dāng)環(huán)磷酰胺損傷Sertoli細(xì)胞，導(dǎo)致抑制素B生成減少，并通過垂體-睪丸軸負(fù)反饋調(diào)控垂體釋放FSH增加；分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺對(duì)腺垂體前葉促性腺細(xì)胞可能有直接損傷作用，抑制垂體一性腺軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，故各組FSH和LH維持相對(duì)平衡。

T淋巴細(xì)胞是相當(dāng)復(fù)雜的不均一體，不斷更新，同一時(shí)間有不同發(fā)育階段或功能亞群，T淋巴細(xì)胞的主要免疫標(biāo)志為CD3，起主要作用的是CD3＋CD4＋亞群和CD3＋CD8＋亞群，T細(xì)胞亞群的比值CD4＋／CD8＋是反映T淋巴細(xì)胞活性的重要指標(biāo)，若比值增加，免疫增強(qiáng)，反之減弱。環(huán)磷酰胺是一種最常用的細(xì)胞毒藥物，通常認(rèn)為是一種免疫抑制劑，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，可損傷機(jī)體的免疫器官，抑制機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，造成免疫功能的低下，表現(xiàn)CD4＋／CD8＋降低，但由于的使用劑量、時(shí)間、方式等不同，環(huán)磷酰胺對(duì)CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD4＋／CD8＋影響結(jié)果明顯不同［9、10］；但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較CD3＋CD4＋、CD4＋／CD8＋明顯降低（P＜0.01），CD3＋CD8＋明顯升高（P＜0.01），表現(xiàn)為免疫抑制功能。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠睪丸遠(yuǎn)期損害明顯，促進(jìn)生殖細(xì)胞凋亡，降低睪酮的分泌，具有抑制T淋巴細(xì)胞免疫功能。因此，研究發(fā)現(xiàn)某些藥物降低環(huán)磷酰胺對(duì)精子發(fā)生的損害，恢復(fù)生育能力，具有重要的臨床意義，也為環(huán)磷酰胺在免疫治療中提供了參考依據(jù)。

［1］Meirow D，Ep stein M，Lewis H，et al.Administration of cyclo- phosphamide at different stages of follicular maturation in mice：effects on rep roductive performance and fetal malformations.Hum Reprod，2001，16 （4），632-637

［2］Van den Berg H，F(xiàn)urstner F，van den Bos C，et al.Decreasing the number of MOPP courses reduces gonadal damage in survivors of childhood Hodgkin disease.Pediatr Blood Cancer，2004，42（3）：210-215

［3］徐叔云，卞如濂，陳修，主編 .藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 .第3版 .北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.198-201

［4］高學(xué)勇，王瑋，韓咪莎，等.環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠睪丸和附睪的影響.解剖學(xué)研究，2009，31（1）：25-27

［5］Choi YJ，Ok DW，Kwon DN，et al.Murine male germ cell apoptosis induced by busulfan Treatment correlateswith loss of c-kit-expression in a Fas／FasL-and p53-independentmanner.FEBS Lett，2004，575（1-3）：41-51

［6］代江濤，李旭良，魏光輝，等.環(huán)磷酰胺對(duì)睪丸組織中SCF表達(dá)的影響及意義 .重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，31（3）：334-337

［7］Kanatsu-Shinohara M，Toyokuni S，Morimoto T，et al.Functional assessment of self-renewal activity of male germline stem cells following cytotoxic damage and serial transplantation.Biol Reprod，2003，68（5）：1801-1807

［8］章振保，楊慶濤，楊鏡秋，等 .淫羊藿甙、菟絲子提取物對(duì)雄激素部分缺乏大鼠生殖保護(hù)作用的比較研究 .中國男科學(xué)雜志，2006，20（8）：13-18

［9］劉繼彥，李永強(qiáng)，彭瑞清，等。環(huán)磷酰胺單次注射對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞及其亞群的早期作用 .中國腫瘤生物治療雜，2005；12（3）：179-182

［10］吳友蘋，張升，陳雁虹，等 .環(huán)磷酰胺兩次問隔注射給藥對(duì)正常大鼠免疫功能的影響 .癌變 .畸變 .突變，2009，21（6）：443-446

The Effect of Cyclophosphamide on the Reproductive Immunity of Male Rats

Han Misha1， Lin Shan2， Gao Xueyong1＊
（1Department of Anatomy，Histology and Embryology，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou350004；2Clinical Laboratory，F(xiàn)uzhou Children＇s Hospital，F(xiàn)uzhou350003，China）

Objective To investigate the toxic effects of cyclophosphamide（CP）on the testis and the cellular immunity of rats.Methods Sixteen 15-week male SD rats were randomly divided into a control and an experimental group.The rats of the experimental group were injected intraperitoneally with cyclophosphamide of 20mg／kg／d×5d.After 2months，the histological changes were examined by light microscopy.The testicular germ cell apoptosis was visualized by TUNEL.Serum testosterone（T），follicle-stimulating hormone（FSH），and luteinizing hormone（LH）levels were detected by radioimmunoassay.Flow Cytometry analysis was used to detect blood T-lymphocyte subsets.Results The average diameter and area of seminiferous tubules，and the cell number of spermatogenic epithelium in the experimental group were all lower than those in controls（P＜0.01）.The spermatozoon was not found in many the seminiferous tubules.The experimental group showed obvious increase of germ cell apoptosis in testicular seminiferous tubules compared with the control group（P＜0.01）.Serum T of the experimental group was significantly decreased（P＜0.01）.There was no significant difference in serum FSH and LH levels between these groups.Compared with those of the control group，CD3＋／CD4＋and CD4＋／CD8＋were decreased significantly（P ＜0.01）and CD3＋／CD8＋increased significantly higher（P ＜0.01）in the experimental group.Conclusion The toxic effects of cyclophosphamide on rat testis are obvious.The germ cell apoptosis is significantly increased.Testosterone secretion of Leydig cells and T lymphocyte immunity are inhibited.

Cyclophosphamide；Germ cell；Cell apoptosis；T lymphocytes

R329.8

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.012

2011-04-06

2011-06-30

韓咪莎，女（1960年），漢族，實(shí)驗(yàn)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）