路 梅， 楊佳妮， 周端頊， 李永強(qiáng)

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

佛手(Citrus medica L．var．sarcodactylis)又名五指橘，為蕓香科常綠灌木或小喬木，果實(shí)張開(kāi)如手指狀，故名佛手．主產(chǎn)于閩粵、川、江浙等省，其中以浙江金華佛手最為著名，被譽(yù)為“果中之仙品，世上之奇卉”，雅稱“金佛手”，具有很高的觀賞和藥用價(jià)值．

佛手的主要病害有潰瘍病、煤煙病和炭疽病．炭疽菌屬(Colletotrichum)是一類重要的植物病原真菌，能引起葉斑、果腐、嫩梢或枝條回枯等癥狀，嚴(yán)重危害多種經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物等，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失．2009年，浙江師范大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從金華市錦林佛手有限公司佛手炭疽病病樣中分離得到一株病原真菌，經(jīng)常規(guī)形態(tài)學(xué)和分子rDNAITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))鑒定，確定為膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioide)．本文主要對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

從金華市錦林佛手公司基地采集佛手炭疽病病樣，在浙江師范大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，采用單孢分離法進(jìn)行病原菌分離純化，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，4℃保存．

1．2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基;胡蘿卜培養(yǎng)基(CA);燕麥培養(yǎng)基(OA);玉米粉培養(yǎng)基(CMA);查氏(Czapek)培養(yǎng)基(CZ)．配方見(jiàn)文獻(xiàn)［1］．

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

接種菌種于PDA培養(yǎng)基中，于25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用滅菌打孔器打取菌落邊緣，打取直徑5 mm的菌餅，用于以下實(shí)驗(yàn)．

1．3．1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

分別接種菌餅于 PDA，CA，OA，CMA，CZ 和水瓊脂平板中央，且菌絲面朝下放置，25℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(下同)．每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理 5 次重復(fù)［2］(下同)．

1．3．2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

接種菌餅至PDA培養(yǎng)基中央，分別在5，10，20，25，28，35 和 40 ℃的恒溫條件下培養(yǎng) 5 d，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，每天測(cè)量菌落直徑．將PDA平板上培養(yǎng)7 d產(chǎn)生的分生孢子用無(wú)菌水洗下，配制成低倍鏡下每視野20～30個(gè)孢子的懸浮液(下同)．將孢子懸浮液滴于凹玻片上，分別置于5～40℃的 7種溫度下保濕培養(yǎng)［3］，并于 6，14和24 h后取出，觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率．

1．3．3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)滅菌后未凝固PDA培養(yǎng)基的pH，制成pH值分別為3，4，5，6，7，8，9，10 和 11 共 9 種培養(yǎng)基，制平板后，接種菌餅至平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)．連續(xù)5 d測(cè)量菌落直徑，求其平均菌落直徑．

用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液配制 pH 值分別為 3，4，5，6，7，8，9，10 和 11 的9種緩沖溶液，用于配制孢子懸浮液，滴于凹玻片上，28℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)6，14和24 h后，鏡檢并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率．

1．3．4 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

設(shè)置連續(xù)光照、12 h明暗交替和完全黑暗3種光照條件，菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d后，測(cè)量菌落直徑．

1．3．5 致死溫度的測(cè)定

取在PDA平板上已活化培養(yǎng)5 d的病原菌，先加入少量無(wú)菌水至培養(yǎng)基上，用滅菌三角玻璃棒刮取菌絲體，然后用滅菌雙層紗布過(guò)濾菌液，濾液為菌絲和分生孢子混合懸浮液．取滅菌具塞玻璃試管，分別置于 40，45，50，55，60 和 65 ℃ 恒溫水浴鍋中，當(dāng)試管內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度時(shí)，加入2 mL病原菌懸浮液，水浴10 min，一支試管在室溫中放置作為對(duì)照．各取0．2 mL經(jīng)過(guò)處理的病原菌懸浮液，涂在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，48 h后觀察有無(wú)菌落出現(xiàn)．

1．3．6 葡萄糖對(duì)孢子萌發(fā)的影響

刮取PDA培養(yǎng)基上病原菌分生孢子，分別放入有 0．1%，0．5%，1%，2%，3%，4% 和 5% 葡萄糖溶液的凹玻片上，輕輕攪動(dòng)，形成孢子懸浮液．將凹玻片放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，置于黑暗條件下28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)．在顯微鏡下觀察和統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間孢子的萌發(fā)率．

1．4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS V7．05數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn);EXCEL 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作．

2 結(jié)果與分析

2．1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

從表1可知，除水瓊脂培養(yǎng)基外，佛手炭疽病病原菌在其余5種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)．在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，氣生菌絲豐富，產(chǎn)孢較多;在CA，OA和CMA培養(yǎng)基上次之;在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差，菌落生長(zhǎng)速度慢，氣生菌絲較少．說(shuō)明該病原菌適宜在半合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)．水瓊脂培養(yǎng)基只含有微量的營(yíng)養(yǎng)和礦物質(zhì)，不能滿足病原真菌的生長(zhǎng)需求．

表1 培養(yǎng)基對(duì)佛手炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2．2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

溫度對(duì)佛手炭疽病病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響較大(見(jiàn)表2)．培養(yǎng)溫度在5～40℃時(shí)，菌絲均可生長(zhǎng);在5～28℃時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)速率隨著溫度的升高而加快，至28℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d平均菌落直徑達(dá)5．95 cm;28℃以上，菌絲生長(zhǎng)速率逐漸降低．在5和40℃下培養(yǎng)5 d，菌落直徑分別為1．03和1．29 cm，有少量菌絲萌發(fā)，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)很差．因此，該病原菌菌絲生長(zhǎng)的最佳溫度范圍為25～28℃，最適溫度為28℃．

表2 溫度對(duì)佛手炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖1 溫度對(duì)佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響

圖1 顯示了不同培養(yǎng)溫度對(duì)佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響．在5～40℃，其孢子均可萌發(fā)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，萌發(fā)率升高．但是，與溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不同，孢子萌發(fā)的最適溫度為20℃．在20℃下，孢子培養(yǎng)14 h的萌發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于培養(yǎng)6 h和24 h的萌發(fā)率．

2．3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響

不同酸堿度的PDA培養(yǎng)基對(duì)佛手炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2．病原真菌在pH 3～11的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，在pH 4～9生長(zhǎng)較好，最適生長(zhǎng)pH值為7，培養(yǎng)5 d平均生長(zhǎng)速率為6．40 cm/d．

圖2 pH對(duì)佛手炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

圖3 pH對(duì)佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)率的影響

圖3 顯示培養(yǎng)基pH對(duì)佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)率的影響顯著．由圖3可知:分生孢子在pH 2～11培養(yǎng)12～48 h都能產(chǎn)孢;而且在一定的酸堿度條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率升高．但是，孢子萌發(fā)率隨pH的變化而變化．在pH 6～9時(shí)，孢子萌發(fā)率較高;在 pH 8時(shí)培養(yǎng)48 h，孢子萌發(fā)率最高，為52．7%;當(dāng) pH值為1和12時(shí)，孢子均不能萌發(fā)．

2．4 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

佛手炭疽病病原菌在不同的光照條件下生長(zhǎng)速率不同．在培養(yǎng)5 d后，菌落生長(zhǎng)速率大小為黑暗條件＞持續(xù)光照＞半光半暗(見(jiàn)圖4)，生長(zhǎng)速率最快為 1．29 cm/d．

圖4 光照對(duì)佛手炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2．5 致死溫度的測(cè)定

佛手炭疽病病原菌懸浮液經(jīng)40～60℃水浴處理10 min后，部分菌絲仍能正常生長(zhǎng);65℃以上溫度處理后，菌絲完全停止生長(zhǎng)，說(shuō)明病原菌的致死溫度為65℃．

2．6 葡萄糖對(duì)孢子萌發(fā)率的影響

不同含量的葡萄糖溶液中佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)顯示(見(jiàn)圖5):在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，孢子萌發(fā)率基本隨著葡萄糖含量的加大而降低;在相同含量的葡萄糖溶液中，孢子萌發(fā)率則隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加大．不同含量的葡萄糖處理對(duì)孢子萌發(fā)率的影響差異顯著．培養(yǎng)36 h后，孢子萌發(fā)率在葡萄糖含量較低與較高之間的差異趨于減小．實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明葡萄糖能夠促進(jìn)其分生孢子的萌發(fā)．在葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1%，培養(yǎng)48 h時(shí)，孢子的萌發(fā)率最高．

圖5 葡萄糖含量對(duì)佛手炭疽病病原菌孢子萌發(fā)的影響

3 討論

佛手是金華地區(qū)的一種傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)植物，已有700多年的栽培歷史．據(jù)金華市相關(guān)部門(mén)統(tǒng)計(jì)，2006年佛手最高畝產(chǎn)純利潤(rùn)可達(dá)20余萬(wàn)元．近年，國(guó)內(nèi)外對(duì)佛手的研究多集中于佛手的栽培［4］、化學(xué)成分的提取和分析［5］、轉(zhuǎn)基因研究［6-9］等方面，對(duì)佛手病原菌的研究甚少．本文對(duì)佛手炭疽病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了首次研究報(bào)道．

微生物的生長(zhǎng)需要一定的營(yíng)養(yǎng)條件．不同的培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的研究發(fā)現(xiàn)，佛手炭疽病病原真菌在半合成培養(yǎng)基(PDA)上生長(zhǎng)速率最快，在合成培養(yǎng)基(CZ)上則生長(zhǎng)勢(shì)較差．這與謝丙炎等［10］對(duì)辣椒炭疽病菌(C．capsici)的研究結(jié)果一致．賀春萍等［11］對(duì)紅毛丹炭疽病菌(C．gloeosporioides)的研究卻認(rèn)為，病原菌無(wú)論是在PDA還是CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)勢(shì)都較好．Estrada等［12］報(bào)道芒果炭疽病菌(C．gloeosporioides)的最適生長(zhǎng)溫度為28℃，致死溫度為65℃ 10 min，與本文的研究結(jié)果一致．佛手炭疽病病原真菌在pH 3～11均可生長(zhǎng)，中性偏酸條件下菌絲生長(zhǎng)較快，pH值為7時(shí)生長(zhǎng)最好，符合真菌對(duì)酸度的適應(yīng)范圍廣并偏好略帶酸性環(huán)境的特性［1］．真菌孢子的萌發(fā)受內(nèi)在因子和環(huán)境條件的影響．佛手炭疽病菌的孢子萌發(fā)最適溫度為20℃，孢子萌發(fā)最適pH值為6～9，與其他關(guān)于膠胞炭疽菌的相關(guān)報(bào)道［10-12］不同．

炭疽菌屬是一類十分重要的植物病原真菌，在熱帶、亞熱帶地區(qū)危害嚴(yán)重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大的損失．本文研究結(jié)果表明，佛手炭疽病病原真菌和其他不同來(lái)源的炭疽病病原真菌的生物學(xué)特性存在一定的差異，這可能與菌株的變異有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)．此外，該病原真菌對(duì)酸堿和高溫的適應(yīng)性很強(qiáng)，在逆境中具有較高的生存能力，加大了防治難度．今后的研究應(yīng)在病原菌侵染機(jī)理和病害防治等方面展開(kāi)．

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