徐莉，潘麗，禤開智

1(海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南 ?？冢?70311) 2(河南工業(yè)大學(xué) 糧 油食品學(xué)院，河南 鄭 州，450052)

低聚半乳糖含量的測(cè)定方法

徐莉1，潘麗2，禤開智1

1(海南省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，海南 ?？?，570311) 2(河南工業(yè)大學(xué) 糧 油食品學(xué)院，河南 鄭 州，450052)

研 究了離子色譜法測(cè)定糖漿中低聚半乳糖含量的方法。用水、250 nmol/L NaOH溶液和1 mol/L乙酸鈉溶液梯度淋洗，選用CarboPac PA10(2 mm×250 mm)色譜柱和安培檢測(cè)器，測(cè)定了糖漿中各組分(乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳糖)的含量。3種糖在測(cè)定條件下線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 7，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54% ～3.42%，樣品的加標(biāo)回收率為91.7% ～95.7%。

離 子色譜法，低聚半乳糖漿，半乳糖

低聚半乳糖作為一種新型功能食品添加劑，廣泛應(yīng)用于焙烤食品、糖果、果醬、清涼飲料、療養(yǎng)食品等中。低聚半乳糖因其顯著的生理功能，如對(duì)腸內(nèi)的雙歧桿菌和乳酸菌有增殖作用，抑制有害菌滋長(zhǎng)，改善礦物質(zhì)吸收，促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)，熱量低，對(duì)熱和酸相對(duì)不易分解，有利于食品加工，延長(zhǎng)商品上架期等。不僅如此，低聚半乳糖是母乳中存在的低聚糖，有人稱之為母乳化的益生元。因此，低聚半乳糖漸漸地成為嬰幼兒奶粉的配料之一，同時(shí)也已成為近年糖生物學(xué)的研究熱點(diǎn)和人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

由于在低聚半乳糖制品中同時(shí)含有單糖、雙糖、三糖及更高的寡糖，半乳糖、葡萄糖和乳糖均為還原糖，使用化學(xué)方法直接測(cè)定很困難。本實(shí)驗(yàn)是在采納AOAC2001.02［1］方法的基礎(chǔ)上，改變陰離子交換柱和淋洗液，有效的分離葡萄糖、半乳糖和乳糖混標(biāo)，并通過對(duì)酶解前后糖漿樣品中半乳糖的含量變化獲得糖漿中低聚半乳糖的總量，評(píng)價(jià)了方法的精密度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國(guó)戴安公司ICS-3000離子色譜儀，配置四元梯度泵和電化學(xué)檢測(cè)器，電子分析天平(上海分析天平儀器公司)，振蕩器(常州澳華儀器有限公司)，氫氧化鈉淋洗液(美國(guó)戴安公司)，醋酸鈉(色譜純，美國(guó)Sigma公司)，無(wú)水葡萄糖、半乳糖、無(wú)水乳糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó) Sima公司)，2.0 U/mg β-半乳糖苷酶(美國(guó)Sima公司)，低聚半乳糖漿(廣東云浮新金山生物有限公司提供)，0.45 μm水系濾膜(美國(guó)millipore)，所用水均為電阻率18.3 MΩ·cm的去離子水。

1.2 色譜條件

色譜柱:分離柱 CarboPac PA10(2 mm×250 mm)，保護(hù)柱CarboPac PA10(2 mm×50 mm);流速:0.25 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:25 μL;淋洗液及其梯度洗脫程序:見表1;檢測(cè)器:電化學(xué)檢測(cè)器脈沖安培檢測(cè)。檢測(cè)電位波形:0.00 s，0.10 V;0.002 s，0.10 V，開始積分;0.04 s，0.10 V，停止積分;0.41 s，－2.00 V;0.42 s，－2.00 V;0.43 s，0.60 V;0.44 s，－0.10 V;0.50 s，－0.10 V。

表1 淋洗液梯度洗脫程序

1.3 溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取0.1 g(精確至0.1 m g)無(wú)水葡萄糖、無(wú)水乳糖、半乳糖于100 mL容量瓶中，用20 mg/L疊氮化鈉溶液定容，配制成濃度約為1 000 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后根據(jù)需要加水稀釋配制成不同濃度的混合標(biāo)樣。

疊氮化鈉溶液(20 mg/L):取疊氮化鈉0.02 g溶于水，定容稀釋至1 000 mL。磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L):稱取22.0 g KH2PO4和6.0 g K2HPO4·3H2O，加水稀釋至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為6.0，滅菌，冷卻。酶解溶液(100 U/mL):稱取適量β-半乳糖苷酶，加入磷酸緩沖溶液配制成100 U/mL酶解液。1.4 樣品前處理

稱取適量低聚半乳糖漿試樣(約含0.1 g～0.3 g低聚半乳糖)置于50 mL聚四氟乙烯管中，加入40 mL 80℃熱磷酸緩沖溶液，混勻，(80±2)℃下振蕩30 min，冰浴冷卻至室溫后，用1 mmol/L NaOH或1 mmol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值在5.7～6.3，稀釋一定的倍數(shù)，為溶液A，備用。

取2個(gè)50 mL聚四氟乙烯管標(biāo)號(hào)為1和2，1號(hào)管加入1 mL酶解溶液和1 mL磷酸緩沖溶液，100℃水浴加熱10 min使酶鈍化失活，冷卻后稱取20 g溶液A置于管內(nèi);2號(hào)管則直接稱取20 g溶液A，加入1 mL酶解液，然后將2個(gè)乙烯管加蓋旋緊搖勻，(60±2)℃下振蕩器輕微振蕩30 min(期間避免起泡)，冰浴冷卻至室溫后，1號(hào)管和2號(hào)管分別加入4 mL和5 mL 20%乙腈，稱重，混勻，10 000 r/min離心10 min，過0.45 μm濾膜后測(cè)定。圖1為1號(hào)管未經(jīng)酶解的糖漿中葡萄糖、半乳糖和乳糖的色譜圖。圖2為2號(hào)管糖漿經(jīng)酶解后樣液的色譜圖。

圖1 未經(jīng)酶解的糖漿色譜圖

圖2 糖漿經(jīng)酶解后樣液的色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)完全參照AOAC2001.02的淋洗梯度和CarboPac PA1(2 mm ×250 mm)陰離子交換柱所得出的葡萄糖、半乳糖和乳糖混合標(biāo)樣分離效果欠佳，半乳糖的分離度僅為0.95;而選擇相同的色譜柱，僅改變其淋洗梯度的色譜圖顯示半乳糖和葡萄糖并未完全分離，半乳糖的分離度也未達(dá)到 1.5［1，2］。根據(jù)PA10柱試驗(yàn)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)對(duì)糖的分離PA10柱更優(yōu)于PA1。

本實(shí)驗(yàn)還參考文獻(xiàn)利用高效液相色譜示差折光檢測(cè)器測(cè)定這3種糖的含量［3］，選用乙腈和水作為流動(dòng)相，當(dāng)體積比例為77∶23時(shí)能夠得到峰型較好的譜圖但葡萄糖和半乳糖的峰完全重疊(如圖3所示)，嘗試將流動(dòng)相比例進(jìn)行調(diào)節(jié)仍無(wú)法分離葡萄糖和半乳糖。因此為取得最佳的試驗(yàn)條件，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，本實(shí)驗(yàn)選用柱容量更大的PA10離子交換色譜柱，淋洗液則選擇水、250 mmol/L NaOH溶液和1mol/L乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫程序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明葡萄糖、半乳糖和乳糖能達(dá)到最佳的分離(如4所示)，完全能夠滿足分離度大于1.5的需要。

圖3 乙腈/水(體積比77∶23)3種糖圖的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

圖4 三種糖的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.2 葡萄糖、半乳糖和乳糖的標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)曲線和相關(guān)系數(shù)

用半乳糖、無(wú)水葡萄糖和無(wú)水乳糖混合工作標(biāo)準(zhǔn)液分別配置不同濃度制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由保留時(shí)間定性，根據(jù)混合工作標(biāo)準(zhǔn)液的濃度及各糖類組分響應(yīng)峰面積，外標(biāo)法定量。工作曲線線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.999 0。3種糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=7.586x+1.658 0;y=9.257 5x+1.896 6;y=6.985 9x+1.629 3，相關(guān)系數(shù)為0.999 2;0.999 0;0.999 7。

2.3 低聚半乳糖漿含量的計(jì)算

由于低聚半乳糖是由一個(gè)葡萄糖分子和n個(gè)半乳糖(n=2～8)分子組成，并不能直接測(cè)定低聚半乳糖的含量。因此，只能通過酶水解使低聚半乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖的方式來求出低聚半乳糖的含量。用高效離子色譜脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定水解后半乳糖的總量，然后減去游離的半乳糖和由無(wú)水乳糖水解產(chǎn)生的半乳糖，從而計(jì)算出試樣中低聚半乳糖的含量。

其中游離的半乳糖可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出，無(wú)水乳糖水解產(chǎn)生的半乳糖由酶解前無(wú)水乳糖含量除以系數(shù)1.9計(jì)算求得，最后相減所得的半乳糖含量乘以換算系數(shù)K為糖漿中低聚半乳糖含量。本實(shí)驗(yàn)對(duì)低聚半乳糖漿樣品作10次平行，平均值為59.3 g/100 g，RSD值為2.28%。

2.4 低聚半乳糖漿測(cè)定方法的驗(yàn)證

表2 無(wú)水乳糖回收率測(cè)定結(jié)果

由于無(wú)法滿足直接添加低聚半乳糖進(jìn)行回收試驗(yàn)，因此實(shí)驗(yàn)中采用添加無(wú)水乳糖純品的方法來計(jì)算回收率，從而檢驗(yàn)酶解的效率。根據(jù)低聚半乳糖漿中乳糖的含量，實(shí)驗(yàn)中每克低聚半乳糖漿中添加約0.2 g的乳糖進(jìn)行酶解，共做10個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，回收率為回收率為91.7% ～95.7%，RSD值為1.54%。

3 結(jié)束語(yǔ)

目前，低聚糖在我國(guó)還是一個(gè)新興行業(yè)，能達(dá)到上千噸生產(chǎn)規(guī)模的只有低聚異麥芽糖和低聚果糖，低聚半乳糖還尚未形成規(guī)模。在我國(guó)生產(chǎn)低聚半乳糖的企業(yè)很少且缺乏相應(yīng)的定量檢測(cè)技術(shù)，從而也限定了低聚半乳糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的高效液相示差法［3］、薄層色譜法［4］和液相柱前衍生化法［5］操作相對(duì)繁瑣，靈敏度低相比，本研究在AOAC2001.02基礎(chǔ)上改進(jìn)的檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便、靈敏度低和精密度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠較好滿足低聚半乳糖含量測(cè)定的需要。

［1］ Slegte J.Determination of trans-galacooligosaccharides in selected food products by ion-exchange chromatography:collaborative study［J］.J AOAC Intern ，2002 ，2(85):417－423.

［2］ 李建文，王竹，楊月欣.高效離子色譜法測(cè)定糖漿中低聚半乳糖含量［J］. 衛(wèi)生研究，2006，35(5):584－586.

［3］ 甘賓賓，蔣世瓊.高效液相色譜法測(cè)定乳糖酶水解產(chǎn)物中的糖類［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27(12):39－40.

［4］ 吳昊，丁鼎，楊思行.高效薄層色譜法分析低聚半乳糖及其共存物［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2001，29(2):25－28.

［5］ 馬定遠(yuǎn)，陳君，李萍等.柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成［J］.分析化學(xué)，2002，30(6):702－705.

Study on the Determination Method of Galacto-oligosaccharide

Xu Li1，Pan Li2，Xuan Kai-zhi1
1(Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，china)2(College of Grain，Oil and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China)

An ion chromatography method was developed for determination of galacto-oligosaccharide in syrup.The components of syrup was eluted with water，250 mmol/L sodium hydroxide solution and 1mol/L sodium acetate solution in gradient，and using the CarboPac PA10(2 mm ×250 mm)column and amperometric detector.The method presented linear correlation coefficient between 0.999 0 and 0.999 7，relative standard deviation(RSD)1.54%and 3.42%.The recoveries of the lactose in syrup sample ranged from 91.7%to 5.7%.The method has many advantages，such as simple operation，fast determination，accurate and highly sensitive.

ion chromatography，galacto-oligosaccharide syrup，galactose

碩士研究生。

2010－03－14，改回日期:2010－11－18