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      節(jié)球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前處理方法研究

      2011-12-20 00:56:42殷浩文
      關(guān)鍵詞:三氟乙酸球藻純水

      李 雙, 殷浩文

      (1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062;2.上海市檢測中心,上海 201203)

      節(jié)球藻和柱胞藻毒素免疫分析的前處理方法研究

      李 雙1, 殷浩文2

      (1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200062;2.上海市檢測中心,上海 201203)

      采用固相萃取前處理技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays,ELISAs)檢測技術(shù),研究了水樣中節(jié)球藻和柱胞藻毒素的免疫前處理方法.由于兩種藻毒素極性差異較大,分別對水樣中節(jié)球藻和柱胞藻毒素采用不同的前處理方法,具體如下.①節(jié)球藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL純水活化C18柱,以3~4 mL/min的速度上樣后用10 mL純水淋洗,再用12 mL甲醇洗脫節(jié)球藻毒素,氮?dú)獯蹈珊蠹兯ㄈ葜? mL待測.②柱胞藻毒素:先后用10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取柱,以2~3 mL/min的速度上樣后用10 mL甲醇淋洗,再用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫柱胞藻毒素,氮?dú)獯蹈珊笥?.1%氨水定容至1 mL待測.結(jié)果表明,這兩種前處理方法對節(jié)球藻與柱胞藻毒素的ElISAs檢測能保證有較好的回收率,加標(biāo)回收率可分別達(dá)到99.4%和77%.

      節(jié)球藻毒素; 柱胞藻毒素; ELISAs

      0 引 言

      自1878年George Francis報(bào)道第一起澳大利亞有毒藍(lán)藻水華事件以來[1],全世界范圍內(nèi)由于加速的水體富營養(yǎng)化(eutrophication)現(xiàn)象而產(chǎn)生的淡水水華越來越多.有毒藻類形成的水華或赤潮越來越頻繁地出現(xiàn)在沿海及內(nèi)陸水域,歐洲、美洲、非洲、大洋洲、中東和亞洲等地區(qū)均出現(xiàn)過藍(lán)藻引發(fā)的水華[2],其中有50%~75%的藍(lán)藻水華會(huì)產(chǎn)生藻毒素[3],并以微囊藻、節(jié)球藻和柱胞藻藻毒素最為常見.它們主要通過飲水或食用被毒素污染的水產(chǎn)品等途徑進(jìn)入人體,進(jìn)而影響人類健康[4].目前對微囊藻毒素的研究較為普遍,而同樣廣泛發(fā)生的節(jié)球藻和柱胞藻毒素由于技術(shù)的原因(微量、干擾嚴(yán)重及前處理復(fù)雜等)研究較少.節(jié)球藻毒素(Nodularins,NOD)是一種環(huán)狀的五肽肝毒素,主要作用于肝臟,能抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1和2A的活性,具有強(qiáng)烈的促肝腫瘤的作用[5],它不僅是腫瘤促進(jìn)劑,也是直接的致癌物質(zhì)[6].柱胞藻毒素(Cylindrospermopsins,CYN)是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種生物堿類肝毒素,主要作用于肝臟和腎臟組織,能夠抑制蛋白質(zhì)的合成,以共價(jià)修飾改變DNA或RNA引起基因損傷.柱胞藻毒素及其代謝物能夠作用于細(xì)胞分裂過程中的紡錘體或著絲粒,導(dǎo)致整個(gè)染色體丟失[7].目前對于節(jié)球藻和柱胞藻毒素的分析方法幾乎空白,而節(jié)球藻和柱胞藻毒素在實(shí)際飲用水中的污染問題卻日漸嚴(yán)重,因此急需一種靈敏、快速、準(zhǔn)確的方法對其進(jìn)行檢測和定量.

      對于藻毒素的前處理研究主要運(yùn)用于高效液相色譜法等化學(xué)檢測中,免疫檢測的樣品都不經(jīng)過前處理,水樣過濾后直接進(jìn)行免疫檢測.由于水樣的復(fù)雜背景會(huì)影響免疫檢測的效果,同時(shí)考慮到免疫檢測的特殊性,應(yīng)用于化學(xué)檢測中的前處理程序也不能直接用于免疫檢測.因此,本文在綜合國內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,采用比較研究的方法,以SPE技術(shù)和ELISAs為手段,對節(jié)球藻和柱胞藻藻毒素的富集前處理做了重點(diǎn)研究.在雜質(zhì)淋洗和目標(biāo)化合物洗脫等關(guān)鍵過程優(yōu)化的基礎(chǔ)上,建立了這兩種藻毒素的前處理方法,以保證水體中痕量毒素檢測的快速性和準(zhǔn)確性.

      1 材料與方法

      1.1 儀器和材料

      C18反相固相萃取柱(Waters,美國);碳黑固相萃取小柱(CNW,德國);0.22μm水相濾膜(MILLI-PORE,美國);酶標(biāo)儀(BioTek,美國);超純水系統(tǒng) (Milli-Q,美國);甲醇(SIGMA,美國);甲酸、三氟乙酸(ACROS,美國);節(jié)球藻毒素/柱胞藻毒素檢測試劑盒(Beacon美國).

      1.2 節(jié)球藻和柱孢藻毒素的檢測步驟

      按照試劑盒說明書操作進(jìn)行.

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      藻毒素的固相萃取前處理流程為:活化柱子→上樣→淋洗→洗脫→吹干定容→Elisa檢測.

      本次實(shí)驗(yàn)對該流程中節(jié)球藻毒素的淋洗,柱胞藻毒素的柱子活化及洗脫給予了重點(diǎn)優(yōu)化,具體步驟如下.

      1.3.1 節(jié)球藻毒素淋洗方式優(yōu)化

      100 mL純水中加入1 mL1μg/L的NOD標(biāo)樣,混勻后通過預(yù)先經(jīng)10 mL純甲醇和10 mL純水活化的C18固相萃取柱,流速3~4 mL/min,然后分別用10 mL純水、10%甲醇和20%的甲醇淋洗,每組做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照,12 mL純甲醇洗脫,收集于底部有刻度的梨形燒瓶中,洗脫液在35℃下用氮吹儀吹干,氮吹過程中用少量純甲醇淋洗瓶壁,吹干后用純水定容至1 mL,并利用水相針式過濾器(0.22μm)過濾到樣品瓶中,根據(jù)1.2步驟檢測,對比純水、10%甲醇和20%甲醇三者的淋洗效果.

      1.3.2 節(jié)球藻毒素湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

      取0.22μm水相濾膜過濾后的淀山湖水100 mL,加入1 mL1μg/L的NOD標(biāo)樣,混勻,上樣后用10 mL純水淋洗,其它步驟同1.3.1.做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.

      1.3.3 柱胞藻毒素固相萃取柱活化方式

      碳黑固相萃取小柱的活化有兩種方式:A組用10 mL純甲醇和10 mL純水活化,B組用10 mL甲醇和10 mL0.1%甲酸水溶液活化,兩組分別做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.100 mL純水中加入1 mL1μg/L的CYN標(biāo)樣混勻,然后以2~3 mL/min的速度通過活化的碳黑固相萃取柱,用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫,收集于底部有刻度的梨形燒瓶中,洗脫液于35℃下用氮吹儀吹干,氮吹過程中用少量純甲醇淋洗瓶壁,吹干后用0.1%氨水定容至1 mL,并利用水相針式過濾器(0.22μm)過濾到樣品瓶中,根據(jù)1.2步驟檢測得出結(jié)果,對比兩種活化方式的效果.

      1.3.4 柱胞藻毒素洗脫溶劑優(yōu)化

      選擇10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,采用純水加標(biāo)的方式,選擇含1%甲酸的50%甲醇和含0.1%三氟乙酸的甲醇作為洗脫溶劑,其他步驟同1.3.3,對比兩種洗脫溶劑的效果,每組分別做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.

      1.3.5 柱胞藻毒素湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

      但是,在RTK技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用過程中,如果系統(tǒng)誤差得不到完全的消除,就會(huì)影響工程數(shù)據(jù)的真實(shí)性、客觀性和準(zhǔn)確性。參考站作為一個(gè)工作站,其校正數(shù)據(jù)的有效作用距離就是RTK技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的最大問題。同時(shí),GPS技術(shù)在使用過程中,受到空間相關(guān)性的影響,其誤差也隨參考站與移動(dòng)站的實(shí)際距離的改變而發(fā)生非線性變化,進(jìn)而導(dǎo)致定位精度降低。因此,在實(shí)際應(yīng)用過程中,必須采取一定的措施降低測量過程中的系統(tǒng)性誤差。

      取0.22μm水相濾膜過濾后的淀山湖水100 mL,加入1 mL2μg/L的CYN標(biāo)樣,混勻,用10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,用含0.1%三氟乙酸的甲醇為洗脫溶劑,其他步驟同1.3.3.做3個(gè)平行加標(biāo)和1個(gè)空白對照.

      2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      2.1 節(jié)球藻毒素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      2.1.1 節(jié)球藻毒素淋洗方式優(yōu)化

      純水、10%甲醇和20%甲醇三者的淋洗效果如表1.結(jié)果顯示,淋洗中隨著甲醇濃度的增加,回收率逐漸降低,即淋洗損失的毒素也越來越多,而純水淋洗則能夠保證回收率在80.6%.因此,節(jié)球藻毒素的淋洗中,本實(shí)驗(yàn)選擇純水作為淋洗溶劑,以減少在這一過程中毒素的損失,保證回收率.

      表1 淋洗方式優(yōu)化Tab.1 Optimization of purge solvent

      2.2 節(jié)球藻毒素湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

      淋洗方式的優(yōu)化結(jié)果顯示純水的淋洗效果較好,為了驗(yàn)證在實(shí)際水樣中整個(gè)固相萃取流程的效果,做了湖水加標(biāo)實(shí)驗(yàn).結(jié)果如表2所示.選擇純水淋洗、甲醇洗脫的整個(gè)固相萃取流程回收率為83%~106.7%,平均回收率為94.3%,表明該固相萃取流程能夠作為實(shí)際水體中節(jié)球藻毒素免疫檢測的前處理方法.?

      表2 NOD湖水加標(biāo)結(jié)果Tab.2 Recoveries of NOD added in lake water

      2.3 節(jié)球藻毒素優(yōu)化后方法

      優(yōu)化后的節(jié)球藻毒素前處理方法如下:分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化柱子,以流速3~4 mL/min上樣,然后用10 mL純水淋洗,12 mL甲醇洗脫,洗脫液于35℃下用氮?dú)獯蹈?,純水定容? mL,4℃保存待測.整個(gè)流程如下,其中重點(diǎn)優(yōu)化步驟為淋洗方式.

      2.4 柱胞藻毒素固相萃取柱活化方式

      純水活化與0.1%甲酸水活化的效果對比如表3.結(jié)果顯示,兩者都能保證實(shí)驗(yàn)的回收率,但是純水活化的效果更好,而且取材方便.因此柱胞藻毒素固相萃取柱的活化就選擇純水,即選擇10 mL純甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱.

      表3 固相萃取柱活化方式Tab.3 Optimization of activation

      2.5 柱胞藻毒素洗脫溶劑優(yōu)化

      用含1%甲酸的50%甲醇和含0.1%三氟乙酸的甲醇作為洗脫溶劑,對比兩種溶劑的洗脫效果,結(jié)果如表4所示.兩者都能充分洗脫柱胞藻毒素,回收率分別是100.4%和118.7%,由于后者在氮吹過程中比前者速度快,因此,洗脫溶劑就選擇0.1%三氟乙酸的甲醇,既能較快完成氮吹過程,又能充分洗脫毒素,提高效率.

      表4 洗脫溶劑優(yōu)化結(jié)果Tab.4 Optimisation of eluent

      表5 CYN湖水加標(biāo)結(jié)果Tab.5 Recoveries of CYN added in lake water

      2.7 柱胞藻毒素優(yōu)化后方法

      柱胞藻毒素的前處理優(yōu)化方法中對柱子的活化方式和毒素的洗脫溶劑進(jìn)行了重點(diǎn)優(yōu)化優(yōu),具體步驟為:10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,以2~3 mL/min的速度上樣,然后用10 mL甲醇淋洗,用12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫毒素,洗脫液在35℃條件下氮?dú)獯蹈桑?.1%氨水定容至1 mL,4℃保存待測.整個(gè)流程為:活化柱子→上樣→10 mL甲醇淋洗→0.1%三氟乙酸甲醇洗脫→吹干0.1%氨水定容→Elisa檢測.

      3 討 論

      ELISAs是應(yīng)用最為廣泛的一種免疫檢測方法,其基本原理是把抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與酶的高效催化作用相結(jié)合.它在實(shí)際檢測中具有一系列的優(yōu)勢,如靈敏度高、檢測速度快等,自1990年ELISAs就開始用于藻毒素的檢測[8].但在實(shí)際水樣的檢測中,由于毒素含量低,水樣背景復(fù)雜,干擾因素多,在分析前一般需要對樣品進(jìn)行預(yù)富集.目前用固相萃取柱(Solid Phase Extraction,SPE)對藻毒素水樣進(jìn)行富集的方法已有很多研究.

      在節(jié)球藻毒素的固相萃取中,洗脫液一般用純甲醇[9-11],也有少數(shù)采用含有0.1%三氟乙酸的甲醇[12].在本實(shí)驗(yàn)的ELISAs檢測中,HRP標(biāo)記的毒素與樣品中的毒素競爭結(jié)合數(shù)量有限的抗體位點(diǎn).研究顯示[13],極少量的三氟乙酸也能強(qiáng)烈抑辣根過氧化物酶(HRP)的活性,甲醇對HRP也有著明顯的抑制作用,從而造成假陽性結(jié)果.因此本文選取純甲醇作為洗脫溶劑,氮?dú)獯蹈珊蠹兯ㄈ?,避免了有機(jī)溶劑對ELISAs反應(yīng)中HRP活性的干擾.湖水加標(biāo)結(jié)果顯示,該方法回收率為83%~106.7%,平均為94.3%,能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要.

      對于柱胞藻毒素的固相萃取前處理,由于它的極性很強(qiáng),在各種固相萃取柱上的保留效果都不是很好,有關(guān)環(huán)境水樣中柱胞藻毒素的富集方法研究尚少.一般是將毒素從藻細(xì)胞或水樣中萃取出來后直接進(jìn)行HPLC-PDA或HPLC-MS/MS分析.Sachiko[14]利用陰離子交換原理在Oasis MAX柱上富集環(huán)境水樣中的柱胞藻毒素,Metcalf[15]用C18柱和碳黑小柱串聯(lián)富集水樣中的柱胞藻毒素,把C18柱接在碳黑小柱前以除去水樣中非極性或弱極性干擾物,得到了滿意的富集效果.目前,國內(nèi)關(guān)于柱胞藻毒素的富集分析方法很少.參考文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),根據(jù)所選柱子的不同,一般有兩種不同的富集方法:甲醇—純水作活化液,1%甲酸的50%甲醇作洗脫液[16],或者是甲醇—含0.1%甲酸的純水作活化液,0.1%三氟乙酸的甲醇作洗脫液[17].本實(shí)驗(yàn)通過純水加標(biāo)的方式對這兩種活化方式和洗脫溶劑進(jìn)行了優(yōu)化.如前文所述,ELISAs檢測中HRP標(biāo)記的柱胞藻毒素與水樣中的毒素競爭結(jié)合有限的抗體,而HRP活性很容易被酸抑制,因此需要考慮氮?dú)獯蹈珊笙疵撘褐袣埩舻乃釋RP的影響.故在洗脫液吹干定容時(shí)用0.1%氨水定容,以避免殘留液中的酸抑制HRP活性造成假陽性的結(jié)果.湖水加標(biāo)結(jié)果顯示,該方法回收率為76%~78%,平均為77%,能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要.

      4 結(jié) 論

      WTO及我國的飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,水體中微囊藻毒素-LR含量不能高于1μg/L.對于節(jié)球藻和柱孢藻毒素,由于發(fā)現(xiàn)較晚且研究資料有限,目前還沒有國家和組織對其進(jìn)行含量限制.因此,本文的前處理方法可為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供基礎(chǔ)依據(jù).

      本文的節(jié)球藻和柱胞藻毒素的免疫前處理過程如下:①節(jié)球藻毒素 分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化柱子,3~4 mL/min的速度上樣后10 mL純水淋洗,12 mL甲醇洗脫,洗脫液在35℃條件下氮?dú)獯蹈珊笥眉兯ㄈ葜? mL,4℃保存待測.②柱胞藻毒素 分別用10 mL甲醇和10 mL純水活化碳黑固相萃取小柱,2~3 mL/min的速度上樣后10 mL甲醇淋洗,12 mL含0.1%三氟乙酸的甲醇洗脫,洗脫液在35℃條件下氮吹儀吹干后用0.1%氨水定容至1 mL,4℃保存待測.這兩種前處理方法對節(jié)球藻和柱胞藻毒素的ELISAs檢測能保證有較好的回收率,加標(biāo)回收率可達(dá)到94.3%和77%,能夠滿足環(huán)境樣品免疫檢測的前處理需要,可用于環(huán)境水樣的監(jiān)測,確保廣大居民的飲用水安全.同時(shí)本方法的研究結(jié)果也能為建立節(jié)球藻和柱胞藻毒素的ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù).

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      Ex-treatment of immunoassay method for nodularin and cylindrospermopsins

      LI Shuang1, YIN Hao-wen2

      (1.School of Life Science,East China Normal University,Shanghai 200062,China;2.The Bioassay and Safety Assessment,Shanghai Academy of Public Measurement,Shanghai 201203,China)

      Effective solid phase extraction (SPE)ex-treatment method and sensitive enzymelinked immunosorbent asssay(ELISA)were developed for determining the nodularins(NOD)and cylindrospermopsins(CYN)in water samples.Due to the different polarities,two different ex-treatment methods were applied to NOD and CYN,respectively.The methods were developed as followed:①For NOD,firstly the C18column was activated by 10 mL methanol and 10 mL Milli-Q water;then the sample was applied to the column at 3-4 mL/min;after washing the column with10 mL water,the NOD was eluted with10 mL methanol;then the eluent was driedup with a rotary evaporator,and lastly the final volume was fixed to 1 mL with Milli-Q water for ELISA analyse.②For CYN,the carb SPE tubes were activated with10mL methanol and 10mL Milli-Q water;then the sample was applied to the tubes at 2-3 mL/min;after washing the tubes with 10mL methanol,the CYN was eluted with12 mL methanol containing 0.1%trifluoroacetic acid;then the eluent was dried up with a rotary evaporator,lastly the final volume was fixed to 1 mL with Milli-Q water containing 0.1%ammonia for ELISA analyse.The results indicated that these methods can guarantee the good recoveries of NOD and CYN for ELISA analyse,which could reach to 94.3%and 77%,respectively.

      nodularins; cylindrospermopsins; ELISAs

      Q89

      A

      10.3969/j.issn.1000-5641.2011.06.013

      1000-5641(2011)06-0108-07

      2010-11

      上海市自然科學(xué)基金(08ZR1416600)

      李雙,女,碩士研究生.E-mail:lis2011@126.com.

      殷浩文,男,教授級(jí)高級(jí)工程師,研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué).E-mail:yinhaowen@126.com.

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