金屬卟啉標記物在化學發(fā)光免疫檢測中優(yōu)勢的理論分析

陳燦玉，袁 通，張現(xiàn)俠，黃志堅

（杭州師范大學生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江杭州 311121）

金屬卟啉標記物在化學發(fā)光免疫檢測中優(yōu)勢的理論分析

陳燦玉，袁 通，張現(xiàn)俠，黃志堅

（杭州師范大學生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江杭州 311121）

為闡述金屬卟啉配合物替代辣根過氧化酶作為標記物進行化學發(fā)光免疫檢測的優(yōu)勢，文章構(gòu)建了簡單的化學發(fā)光免疫檢測模型，分析了化學發(fā)光免疫反應中的平衡方程.結(jié)果表明：金屬卟啉配合物作為標記物在理論上可以提高信噪比2個數(shù)量級以上；與酶標法相比，高純度的金屬卟啉標記抗體大大降低了非特異吸附本底信號和檢測體系的系統(tǒng)誤差，極大提高了化學發(fā)光免疫檢測的靈敏度和準確度.

金屬卟啉；標記；化學發(fā)光；免疫分析

0 引 言

卟啉（porphyrins）是卟吩（porphine）外環(huán)帶有取代基的衍生物的總稱，是一類特殊的大環(huán)共軛芳香體系，當其氮上的兩個質(zhì)子被金屬離子取代后即成金屬卟啉配合物.自然界中存在許多天然卟啉及其金屬配合物，它們廣泛存在于動植物中，具有特殊生理活性，如血紅素、葉綠素、維生素B12、細胞色素P-450等.目前，金屬卟啉及其衍生物主要用于不對稱催化合成［1］，烯烴環(huán)氧化［2－3］，轉(zhuǎn)移、儲存、還原雙氧［4－9］和生物能量學（光合成［10－11］和電子轉(zhuǎn)移［12－13］），還可以用于疾病治療（光動力治療［14］以及分解人類疾病所產(chǎn)生的O－2，H2O2，ONOO－和脂類過氧基團［15－16］）等.此外，卟啉及其金屬配合物也可以作為酶的模擬物替代酶在分析化學如光度分析、熒光分析以及化學發(fā)光中加以應用［17］.

1982年，Ikarlyama等［18］以氯化血紅素代替辣根過氧化酶（HRP），用碳二亞胺法將其標記在人血清白蛋白（HSA）上，結(jié)合固體酶免疫分析技術(shù)，對HSA的化學發(fā)光免疫測試進行初步探討.他們這一開創(chuàng)性的研究，為金屬卟啉在酶免疫分析中的應用奠定了基礎(chǔ).1984年，Hara等將鐵卟啉配合物標記于HSA抗體上用于檢測HSA［19］，并將這一體系應用于分析化學中［20］.1992年，Adam等對鐵卟啉和錳卟啉的催化機理進行研究，并與HRP的催化發(fā)光效應進行了比較［21］.1993年和1994年，Motsenbocker等用光敏劑和金屬卟啉標記抗體進行免疫檢測［22－24］.國內(nèi)，慈云祥等對金屬卟啉催化劑替代HRP催化化學發(fā)光反應也進行了一些探索［17］.這些工作從實驗上證實了金屬卟啉配合物可作為免疫檢測的標記物，但是它們并沒有從理論上（根本上）討論采用金屬卟啉作為標記物比酶標記更優(yōu)越的地方.

酶免疫分析試劑具有靈敏度高、成本低、可大規(guī)模操作等優(yōu)點，是目前免疫市場的主流，但其高分子量所帶來的非特異吸附本底會降低其特異檢測的靈敏度，同時還具有穩(wěn)定性差、與生物分子耦合方法復雜、純化困難等缺點.而金屬卟啉配合物具有分子量小、穩(wěn)定、標記簡單和吸附低的優(yōu)點，并能催化H2O2和luminol的氧化還原反應而循環(huán)產(chǎn)生大量具有高檢測靈敏度（無激發(fā)本底）的光信號（金屬卟啉催化所產(chǎn)生的光信號與HRP的相當［21］）.在酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建金屬卟啉配合物標記化學發(fā)光免疫檢測技術(shù)，集合化學發(fā)光免疫檢測及酶標方法的優(yōu)點，克服酶標方法高非特異本底信號的缺陷.該技術(shù)的最大優(yōu)勢在于：金屬卟啉催化劑和抗體耦合后很容易將游離的金屬卟啉分子與耦合物分離，得到高純度的標記抗體，降低非特異吸附本底信號，從而極大提高檢測靈敏度.該文將用一個簡單的理論模型加以說明.

1 理論模型

簡單的化學發(fā)光免疫檢測模型如圖1所示.首先，將待測樣品（抗原）包被于固相載體上，洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì).然后加入經(jīng)金屬卟啉配合物（或酶）標記的抗體，與已經(jīng)結(jié)合在固相載體上的待測樣品反應，洗滌，除去未結(jié)合的金屬卟啉（或酶）標記抗體.最后加入發(fā)光底物而發(fā)光，檢測發(fā)光強度.根據(jù)標準曲線對待測樣品的濃度進行定量分析.

圖1 化學發(fā)光免疫檢測技術(shù)的簡單模型Fig.1 Simple model of the chemiluminescence immunoassay

2 理論計算

在整個檢測技術(shù)模型中，第二步即抗原抗體免疫反應為最關(guān)鍵的一步.這一步反應過程中存在3個反應平衡，如圖2所示.

圖2 標記物反應過程中的3個反應平衡Fig.2 Three reaction balances of labels in the immune reaction

圖2中反應（1）、（2）、（3）分別表示待測抗原與標記抗體結(jié)合、過量標記抗體與載體的非特異性結(jié)合、殘存的游離標記物與載體的非特異性結(jié)合的反應方程式.假定A表示為標記抗體的量，A′為殘存游離標記物的量，B為抗原的量，C為載體上抗體非特異性結(jié)合位點的量，D為載體上游離標記物非特異性結(jié)合位點的量，x為抗體抗原結(jié)合的量，y為抗體與載體非特異性結(jié)合的量，z為游離標記物與載體非特異性結(jié)合的量，那么，

由于x（抗體抗原結(jié)合的量）為特異性信號，y（抗體與載體結(jié)合的量）和z（酶／金屬卟啉配合物與載體結(jié)合的量）為非特異性信號，因此信噪比（R）：

3 結(jié) 語

采用金屬卟啉配合物替代HRP作為標記物的化學發(fā)光免疫檢測方法，集合化學發(fā)光免疫檢測及酶標方法的優(yōu)點，克服了酶標方法高非特異吸附本底信號及低標記率的缺陷，進一步提高檢測的靈敏度和準確度.該方法簡便、快速，易實現(xiàn)自動化，不僅具有免疫反應的特異性、化學發(fā)光反應的高靈敏性，而且還具有化學標記物的穩(wěn)定性.據(jù)此開發(fā)設(shè)計金屬卟啉配合物標記的化學發(fā)光免疫分析試劑及其臨床診斷試劑，可實現(xiàn)樣品的大量普查、隨機檢測，達到快速、高靈敏度的檢測目的，具有巨大的市場價值和產(chǎn)業(yè)化前景.

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Theoretical Analysis on the Ascendancy of Metalloporphyrins as the Label in the Chemiluminescence Immunoassay

CHEN Can-yu，YUAN Tong，ZHANG Xian-xia，HUANG Zhi-jian
（Research Center of Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China）

In order to illustrate the ascendancy of metalloporphyrins as the label in the chemiluminescence immunoassay instead of HRP，the paper constructed simple model of chemiluminescence immunoassay，and analyzed the balance equations in the reaction.The results show that the signal-noise ratio can increase over two orders of magnitude with the metalloporphyrins as the label in theory.Comparing with the enzyme linked immunosorbent assay，highly purified metalloporphyrins can much decrease the non-specific adsorbed background signals as well as the systematic error of the detection，and greatly improve the sensitivity as well as the accuracy of the chemiluminescence immunoassay.

metalloporphyrins；label；chemiluminescence；immunoassay

R392-33

A

1674-232X（2011）03-0233-04

10.3969／j.issn.1674-232X.2011.03.009

2010-11-13

浙江省重大科技專門項目（2008C12063）；杭州市科技發(fā)展計劃項目（20100933B10）；杭州師范大學科研項目（YS05203133）.

陳燦玉（1981—），男，福建泉州人，助理研究員，博士，主要從事金屬卟啉配合物的合成及其在診斷試劑方面的研究.E-mail：chency＠hznu.edu.cn