張 晶， 戚仁斌， 汪志剛， 趙彥儒， 王華東， 陸大祥

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，暨南大學(xué)腦科學(xué)研究所，國家中藥管理局三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510632)

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物與主要試劑

1.1 動(dòng)物 新生24 h 內(nèi)SD 乳鼠，SPF 級(jí)，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK 粵2006－0015。

1.2 主要試劑 遠(yuǎn)志皂苷元，購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度＞98%。DMEM－F12 培養(yǎng)基、胎牛血清購于Hyclone。Neurobasal 培養(yǎng)基、B27 購于Gibco。四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、Hoechst 33258 購于Sigma。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。Trizol 購于Invitrogen。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega。SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒購于TaKaRa。3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體、Bcl－2、Bax 兔抗大鼠多克隆抗體來自CST。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 來自北京鼎國昌盛生物有限公司。

1.3 主要儀器 微量核酸分光光度計(jì)(Thermo scientific)，多功能全波長酶標(biāo)儀(Tecan)，熒光顯微鏡(Olympus)，梯度PCR 儀(PerkinElmer)，lightcycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Roche)，Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio－Rad)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 新生24 h 內(nèi)的SD 大鼠，無菌條件下斷頭取腦，分離海馬組織，置于終濃度為0.125%胰酶的PBS 中，快速剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右組織塊，37 ℃消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM－F12 培養(yǎng)基終止消化，200 目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以3.5 ×108/L 的密度種于培養(yǎng)板(多聚賴氨酸包被過夜)中，4 h 后全量換為含2%B27 的Neurobasal 培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)至第6 d，經(jīng)MAP2 鑒定神經(jīng)元純度后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分正常組、H2O225 μmol/L、H2O250 μmol/L、H2O275 μmol/L、H2O2100 μmol/L 4 個(gè)濃度模型組，培養(yǎng)12 h 后，每孔加入0.5% MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，充分溶解，酶標(biāo)儀570 nm 波長測定吸光度(absorbance，A)值，檢測細(xì)胞存活率。

2.2 Sen 對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)元的影響

①Sen 對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響 海馬神經(jīng)元接種于96 孔板中，實(shí)驗(yàn)分正常組及Sen 10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L 5 個(gè)組，培養(yǎng)2 h 和12 h 后，MTT 法檢測細(xì)胞存活率，篩選對(duì)神經(jīng)元無損傷的藥物濃度。

②Sen 對(duì)氧化損傷海馬神經(jīng)元存活率的影響 96 孔板中分別加入20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen，預(yù)培養(yǎng)12 h，然后加入終濃度為50 μmol/L 的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，MTT 法檢測細(xì)胞存活率。

③MDA、SOD 檢測 細(xì)胞分組同②，藥物干預(yù)神經(jīng)元后，裂解、收集細(xì)胞。取100 μL 收集液按照SOD和MDA 試劑盒說明書操作，測定吸光度值，并用BCA 法對(duì)細(xì)胞蛋白含量測定。

2.3 Sen 對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)元的作用機(jī)制研究

①Sen 對(duì)H2O2損傷的海馬神經(jīng)元凋亡的影響 Hoechst 33258 是一種能夠穿透胞膜，結(jié)合DNA 的藍(lán)色熒光染料，常用于細(xì)胞凋亡的檢測。海馬神經(jīng)元經(jīng)藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min，然后PBS 清洗2 次，加入Hoechst 33258 避光染色10 min，倒置顯微鏡下拍照。

②Real－time PCR 檢測bcl－2 和bax 基因表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為4 組，正常組、50 μmol/L H2O2組、Sen 20 μmol/L +H2O2組和Sen 20 μmol/L 藥物組。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，然后微量核酸分光光度計(jì)分析RNA 濃度和純度。按照Promega 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取2 μg RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)總體系為25 μL。取逆轉(zhuǎn)產(chǎn)物cDNA 2 μL 進(jìn)行PCR 循環(huán)。設(shè)置反應(yīng)為95 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃10 s，42 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT方法處理。根據(jù)GenBank 序列，采用分子生物學(xué)分析軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)引物，序列如下:bcl－2 上游引物5'－TGAACCGGCATCTGCACAC－3'，下游引物5'－CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG－3'，產(chǎn)物長度116 bp。bax 上游引物5'－AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG－3'，下游引物5'－GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA－3'，產(chǎn)物長度197 bp。GAPDH 上游引物5'－GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG－3'，下游引物5'－ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA－3'，產(chǎn)物長度143 bp。

③Western blotting 檢測Bcl－2 和Bax 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組同real－time PCR，棄板中培養(yǎng)液，每孔中加入60 μL 細(xì)胞裂解液裂解30 min，然后轉(zhuǎn)移到離心管中，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，分裝上清，－80℃保存。蛋白經(jīng)BCA 法定量后，配制SDS 聚丙烯酰胺凝膠，上樣電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移，抗體孵育，顯影。結(jié)果以目的條帶與GAPDH 條帶的灰度比值評(píng)定蛋白質(zhì)表達(dá)相對(duì)含量。

④Caspase－3 活性檢測 實(shí)驗(yàn)分組同real－time PCR，室溫下解凍100 ×酶作用物和緩沖稀釋液，渦旋振蕩器混勻酶作用物，用緩沖稀釋液將100 ×酶工作液稀釋至1 ×酶工作液，臨用前配好。按照培養(yǎng)液∶酶工作液=1∶1 比例向96 孔板中加入酶工作液，微量振蕩器振蕩30 s，25 ℃孵育60 min，酶標(biāo)儀檢測發(fā)光值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 模型建立

細(xì)胞培養(yǎng)6 d 后，胞體呈梭形或三角形，突起增多、延伸，并且可見突起延伸形成的網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)MAP－2鑒定后，神經(jīng)元數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)90%以上，可用于實(shí)驗(yàn)。25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L H2O2作用神經(jīng)元12 h 后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞損傷程度與H2O2濃度呈劑量相關(guān)性，MTT 結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率分別為(95.6 ±11.6)%、(73.1 ±6.8)%、(61.5 ±5.6)%、(58.8±9.5)%，本實(shí)驗(yàn)選擇50 μmol/LH2O2作為細(xì)胞造模濃度，見圖1。

Figure 1. Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability in hippocampal neurons. ± s. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 H2O2 對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響

2 Sen 對(duì)海馬神經(jīng)元的影響

2.1 Sen 對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響 不同濃度Sen 與海馬神經(jīng)元共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，培養(yǎng)2 h，Sen 對(duì)細(xì)胞存活率未見明顯影響，而培養(yǎng)12 h后，Sen 濃度為20 μmol/L 和40 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率分別為(116.3 ±2.7)%和(109.0 ±2.9)%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. Effect of different concentrations of Sen on cell viability in hippocampal neurons at different time points. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同遠(yuǎn)志皂苷元濃度和時(shí)間對(duì)海馬神經(jīng)元存活率的影響

2.2 Sen 對(duì)氧化損傷的海馬神經(jīng)元存活率的影響

與正常組相比，H2O2組細(xì)胞存活率約為(76.8 ±9.8)%，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L Sen 藥物預(yù)處理后，細(xì)胞存活率升高，分別為(90.5 ± 8.9)%、(87.8 ±8.1)%、(86.6±7.5)%，差異顯著(P ＜0.05)，見圖3。

Figure 3. Effect of Sen on viability of hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control(non－treatment);#P ＜0.05 vs H2O2 group.圖3 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的存活率影響

2.3 Sen 對(duì)神經(jīng)元胞內(nèi)MDA 含量和SOD 活性的影響 與正常組相比，H2O2組細(xì)胞SOD 活性降低，MDA 含量升高，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen 預(yù)處理組細(xì)胞，SOD 活性提高，MDA 含量降低，差異顯著(P ＜0.05);其它濃度組未見明顯區(qū)別，見表1。

表1 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)SOD 活性和MDA 含量的影響Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

表1 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)SOD 活性和MDA 含量的影響Table 1. Effect of Sen on activity of SOD and content of MDA in hippocampal neurons treated with H2O2(±s.n=3)

* P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs H2O2 group.

Group SOD(103U/g protein) MDA(μmol/g protein)Control 26.72±2.08 1.48±0.09 H2O2 50 μmol/L 13.10±0.95* 2.70±0.26*H2O2+Sen 20 μmol/L 19.60±3.95# 1.99±0.15#H2O2+Sen 30 μmol/L 18.80±1.68 2.31±0.10 H2O2+Sen 40 μmol/L 18.61±2.04 2.38±0.16

3 凋亡相關(guān)檢測結(jié)果

3.1 Hoechst 33258 染色形態(tài)觀察 Hoechst 33258細(xì)胞核染色后拍照，圖4A 示正常組，細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻低強(qiáng)度熒光，見少量高亮濃染的凋亡形態(tài)細(xì)胞;圖4B 示H2O2組，見大量細(xì)胞核濃染、高亮固縮，凋亡特征的細(xì)胞多于正常組;圖4C 示20 μmol/L Sen +H2O2組，高亮藍(lán)染的凋亡形態(tài)細(xì)胞比H2O2組少;圖4D 示Sen 單獨(dú)處理細(xì)胞組，凋亡特征形態(tài)的細(xì)胞數(shù)與正常組相比，未見明顯差別。

Figure 4. Morphological changes of nucleus of apoptotic hippocampal neurons shown by Hoechst 33258 staining. The apoptotic cells are indicated by arrows (×200).A:control group;B:H2O2 50 μmol/L group;C:H2O2 +Sen 20 μmol/L group;D:Sen 20 μmol/L group.圖4 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷形態(tài)的影響

3.2 bcl－2 mRNA 表達(dá) Real－time PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組抗凋亡基因bcl－2 表達(dá)下調(diào)，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen+H2O2組bcl－2 mRNA 表達(dá)升高，差異顯著(P ＜0.05);Sen 單獨(dú)處理組與正常組未見明顯差異，見圖5。

Figure 5. Effect of Sen on the expression of bcl－2 mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n=4. #P ＜0.05 vs control (non－treatment)* P ＜0.05 vs H2O2 group.圖5 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元bcl－2 mRNA 表達(dá)的影響

3.3 bax mRNA 表達(dá) Real－time PCR 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組bax表達(dá)下調(diào)，差異顯著(P＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen +H2O2組bax mRNA 表達(dá)升高，差異顯著(P ＜0.05);Sen 單獨(dú)處理組與正常組未見明顯差異，見圖6。

Figure 6. Effect of Sen on the expression of bax mRNA in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. #P ＜0.05 vs control(non－treatment);* P ＜0.05 vs H2O2 group.圖6 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)bax mRNA表達(dá)的影響

3.4 Bcl－2 蛋白表達(dá) Western blotting 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組Bcl－2 蛋白表達(dá)下降，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen +H2O2組Bcl－2 表達(dá)升高，差異顯著(P ＜0.05);與正常組相比，Sen 單獨(dú)處理組Bcl－2 表達(dá)升高，差異顯著(P ＜0.05)，見圖7。

3.5 Bax 蛋白表達(dá) Western blotting 結(jié)果顯示，與正常組相比，H2O2組Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen+H2O2組Bax 表達(dá)下降，差異顯著(P ＜0.05)，見圖8。

3.6 Sen 對(duì)caspase－3 活性的影響 與正常組相比，H2O2組caspase－3 活性升高，差異顯著(P ＜0.05);與H2O2組相比，20 μmol/L Sen+ H2O2組細(xì)胞caspase－3 活性降低，差異顯著(P ＜0.05)，見圖9。

Figure 7. Effect of Sen on the expression of Bcl－2 protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n=3. *P ＜0.05 vs control (non－treatment);#P ＜0.05 vs H2O2 group.圖7 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)Bcl－2 蛋白表達(dá)的影響

Figure 8. Effect of Sen on the expression of Bax protein in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s. n =3. * P＜0. 05 vs control(non－treatment);#P ＜0. 05 vs H2O2 group.圖8 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)Bax 蛋白表達(dá)的影響

Figure 9. Effect of Sen on the activity of caspase－3 in hippocampal neurons treated with H2O2. ±s.n =3. #P ＜0.05 vs control(non－treatment);* P ＜0.05 vs H2O2 group.圖9 遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元caspase－3 活性的影響

討 論

近年來研究表明，ROS 引起的氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病有密切聯(lián)系，這與神經(jīng)元需氧和耗氧高于機(jī)體內(nèi)其它類型細(xì)胞有關(guān)，因此，神經(jīng)元受到ROS攻擊時(shí)，更容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。Ma 等［7］發(fā)現(xiàn)提高線粒體內(nèi)SOD 活性，可以改善由于氧化應(yīng)激引起的AD 模型小鼠Tg2576 小鼠記憶障礙;在快速老化小鼠SAMP10 的海馬研究中發(fā)現(xiàn)，其神經(jīng)元線粒體SOD 活性明顯低于正常小鼠，而MDA 含量則高于正常小鼠(P ＜0.01)，說明其在其海馬組織中的自由基含量有所增高，亦提示氧化應(yīng)激損傷可能是AD 發(fā)生的重要因素之一［8］。Whittemore 等［9］通過H2O2誘導(dǎo)大鼠皮層神經(jīng)元損傷，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特異DNA 染色以及DNA ladder 檢測，發(fā)現(xiàn)H2O2可能介導(dǎo)了Aβ 誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡;Hensley 等［10］運(yùn)用水楊酸羥化法也證實(shí)在無細(xì)胞的Aβ(25－35)培養(yǎng)液中能夠產(chǎn)生活性氧，而且氧化作用敏感的酶失活，如谷氨酰胺合成酶。此外，還有研究表明Aβ 可以通過ROS 氧化作用加重對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)細(xì)胞因子引起的炎癥反應(yīng)［1］。因此，氧化應(yīng)激是AD 發(fā)病中的重要因素之一，也基于這個(gè)原因，從氧化應(yīng)激多個(gè)環(huán)節(jié)來研究AD 發(fā)病機(jī)制和防治措施逐漸成為共識(shí)。

本室先前自擬中藥Q0409 組方［4］和抗衰益智方Ⅰ［5］(主要成分為遠(yuǎn)志)可以改善SAMP－8 小鼠、東莨菪堿所致記憶障礙小鼠和自然衰老記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并且能提高正常小鼠腦內(nèi)乙酰膽堿含量，從而提高正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。為了進(jìn)一步探討Q0409 組方和抗衰益智方Ⅰ抗AD 機(jī)制，我們?cè)诖搜芯炕A(chǔ)上，選擇上述組方的主要單體成分之一遠(yuǎn)志皂苷元進(jìn)行深入研究。已有的研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷元具有一定的抗氧化損傷的作用，如田楓等［11］研究遠(yuǎn)志皂苷元能顯著提高快速老化癡呆模型小鼠SAMP/8 腦組織總蛋白含量、總抗氧化能力和促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成，孫桂波等［12］觀察遠(yuǎn)志皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的作用，結(jié)果顯示其能夠明顯改善細(xì)胞存活率，LDH 漏出量、MDA 含量降低，SOD 活性升高(P ＜0.01)。

本研究采用H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷模型，觀察遠(yuǎn)志皂苷元對(duì)其作用并探討機(jī)制，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，50 μmol/L H2O2作用于海馬神經(jīng)元12 h 即可造成細(xì)胞氧化損傷，神經(jīng)元存活率下降，SOD 活性降低，MDA 含量升高，而細(xì)胞經(jīng)過Sen 預(yù)處理后，Sen 劑量與神經(jīng)元存活率具有量效關(guān)系，20 μmol/L Sen 處理后抗氧化能力增強(qiáng)顯著，這與文獻(xiàn)報(bào)道皂苷物質(zhì)對(duì)氧自由基本身影響較少，而大部分可能提高體內(nèi)SOD 等抗氧化酶活性，從而減輕氧自由基對(duì)機(jī)體損傷［13］相一致。低濃度H2O2作用于細(xì)胞時(shí)，可通過影響凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與相關(guān)基因功能，造成細(xì)胞凋亡，其中Bcl－2 家族和caspase－3 家族在H2O2誘導(dǎo)的凋亡過程中起重要作用［14－16］。我們通過Hoechst 33258 染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)H2O2作用后細(xì)胞核呈凋亡特征性改變，而20 μmol/L Sen 預(yù)處理組較H2O2組凋亡細(xì)胞減少，進(jìn)一步觀察Bcl－2 家族蛋白及caspase－3 表達(dá)，結(jié)果證實(shí)，與正常組相比，H2O2組Bcl－2 蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax 蛋白表達(dá)上調(diào)，caspase－3 活性升高，而20 μmol/L Sen+ H2O2組，Bcl－2 蛋白表達(dá)增加，Bax 蛋白表達(dá)下降，caspase－3 活性降低，提示Sen 可能通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白從而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，遠(yuǎn)志皂苷元可以通過提高海馬神經(jīng)元抗氧化酶的活性，抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示遠(yuǎn)志皂苷元具有防治AD 的應(yīng)用前景，該作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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