王 華， 周 濱， 郭 星， 朱雋雅， 程 春， 朱昌來， 張?zhí)煲弧?/p>

(南通大學1 附屬醫(yī)院普外科，2 醫(yī)學院，3 神經再生重點實驗室，江蘇 南通226001)

人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2，Rh2)是中草藥人參所含的重要活性成分之一，國內外學者研究證實了Rh2對多種惡性腫瘤細胞具有顯著的抗轉移作用［1，2］。另外，也有學者研究表明，人參皂苷還對腫瘤細胞具有誘導分化作用，但其具體作用機制尚不清，尤其是對腫瘤細胞骨架的影響尚未闡明，而細胞骨架構型的改變是腫瘤細胞惡性增殖和轉移的重要因素之一［3］。本研究通過分析Rh2對SMMC－7721 細胞增殖及細胞骨架影響，為探討Rh2對惡性腫瘤細胞誘導分化后轉良的過程提供一些實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

SMMC－7721 細胞株(中科院細胞所);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);MTT 試劑(Fluka);FITC－phalloidin(上海聯(lián)科生物科技);人參皂苷Rh2(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);酶聯(lián)免疫檢測儀(Bio－Tek);流式細胞儀(FACS Callibur，BD);激光共聚焦顯微鏡(TCS－SP2，Leica);透射電子顯微鏡(JEM－1230，JEOL)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) SMMC－7721 細胞生長于含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

2.2 MTT 法測細胞生長抑制率 將培養(yǎng)的腫瘤細胞按5 ×107/L 的密度接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細胞懸液。實驗設置空白對照組及4 個實驗組(每組終濃度分別為10、20、30、40 mg/L Rh2)，每組設置4 個平行孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱里分別培養(yǎng)2 d、4 d、6 d 后MTT 法測定波長為570 nm 處各孔的吸光度(A)值。

細胞生長抑制率=(1－實驗組吸光度/對照組吸光度)×100%。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將細胞按5 ×107/L 的密度接種于24 孔培養(yǎng)板，每孔0.5mL。實驗設置空白對照組及實驗組(每組終濃度分別為10、20、40 mg/L Rh2)，每組設置4個平行孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱里分別培養(yǎng)4 d。收集上述各組細胞，PBS 漂洗，4℃70%乙醇固定細胞24 h，離心去除乙醇，漂洗后重懸細胞于0. 5 mL PBS 中，加入5 g/L RNase A 10 μL，37 ℃水浴中孵育30 min 后，加入1 g/L 的碘化丙啶25 μL，4 ℃染色30 min，流式細胞儀檢測。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架肌動蛋白絲 根據MTT 及流式細胞儀分析的結果確定孔內先置入經無菌處理過的圓形蓋玻片，將細胞按5 ×107/L 的密度接種于24 孔培養(yǎng)板，每孔0. 5mL。設空白對照組和實驗組(10、20 mg/L Rh2)，每組設4 個復孔。作用4 d 后，PBS 漂洗2 次，加入4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，PBS 漂洗2 次，Hoechst33258 室溫避光孵育15 min，PBS 漂洗，F(xiàn)ITC－phalloidin 室溫避光孵育2h，PBS 漂洗、無熒光封片劑封片檢測。

2.5 整裝電鏡技術觀察細胞核基質－中間纖維系統(tǒng) 參照文獻方法［4］，將細胞接種于鎳網(預先覆蓋Formvar 膜、噴碳并涂0.1%多聚賴氨酸紫外線照射滅菌30 min ，置于24 孔培養(yǎng)板內)，設空白對照組及實驗組(10、20 mg/L 的Rh2)。作用4 d 后，培養(yǎng)細胞經PBS 37 ℃下漂洗2 次，4 ℃下高離子強度提取液［PIPES 10 mmol/L，(NH4)2SO4250 mmol/L，sucrose 300 mmol/L，MgCl23 mmol/L，PMSF 1. 2 mmol/L，Triton X－100 0.5%，pH 6.8］抽提3 min，無酶消化液(PIPES 10 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，sucrose 300 mmol/L，MgCl23 mmol/L，PMSF 1.2 mmol/L，Triton X－100 0.5%，pH 6.8)漂洗。含酶消化液(DNase I 400 mg/L;RNase A 400 mg/L)23 ℃下消化20 min，再經高離子強度提取液23 ℃下再抽提5 min。2% 戊二醛(無酶消化液配制)于4 ℃預固定30 min;0.1 mol/L 二甲砷酸鈉緩沖液(pH 7.4)漂洗后，再用1%鋨酸4 ℃固定5 min，并經乙醇梯度脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥后透射電鏡下觀察。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據統(tǒng)計處理采用Stata 7.0 軟件，數(shù)據以均數(shù)±標準差(±s)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析。

結 果

1 Rh2 對人肝癌細胞生長抑制作用

Rh2對SMMC－7721 細胞的增殖有顯著抑制作用，其抑制率分別與藥物的劑量及處理時間呈正相關，見表1。

表1 人參皂苷Rh2 對SMMC－7721 細胞增殖的影響Table 1. Effect of Rh2 on the proliferation of SMMC－7721 cells(±s.n=4)

表1 人參皂苷Rh2 對SMMC－7721 細胞增殖的影響Table 1. Effect of Rh2 on the proliferation of SMMC－7721 cells(±s.n=4)

* P ＜0.05 vs control group.

Group 2 d 4 d 6 d A value Inhibitory rate(%) A value Inhibitory rate(%) A value Inhibitory rate(%)Rh210 mg/L 0.42 ±0.06* 28.70 ±0.30 0.61 ±0.23* 31.50 ±0.52 0.98 ±0.23*44.30 ±0.28 Rh220 mg/L 0.35 ±0.04* 34.10 ±0.25 0.56 ±0.08* 42.90 ±0.42 0.85 ±0.33* 51.60 ±0.46 Rh240 mg/L 0.15 ±0.05* 73.30 ±0.39 0.10 ±0.02* 87.40 ±0.71 0.97 ±0.21* 88.30 ±0.39 Control 0.55 ±0.02－0.85 ±0.12－1.68 ±0.15－

2 Rh2 對人肝癌細胞凋亡率的影響

采用流式細胞儀檢測凋亡細胞數(shù)量百分比，紅色峰代表正常的二倍體，淡藍色峰代表亞二倍體，即凋亡峰，峰的高度代表凋亡率。作用4 d 后，40 mg/L 組的細胞凋亡率約為(31.93 ±0.52)%，明顯大于同期空白組及10 mg/L、20 mg/L 組［(4. 55 ±0. 23)%、(4. 81 ±0. 31)%、(5. 10 ±0.45)%］，說明高濃度人參皂苷Rh2對SMMC－7721 細胞有明顯促進凋亡的作用，而較低濃度時誘導凋亡的作用較弱，見圖1。

3 Rh2 對人肝癌細胞的胞質內F－actin 的影響

人參皂苷Rh2作用4 d 后，通過熒光雙標記，激光共聚焦顯微鏡觀察結果表明，對照組SMMC－7721 細胞微絲顯示紊亂，排列無序，數(shù)量較少，見圖2A;10 mg/L Rh2作用下，F(xiàn)－actin 排列仍紊亂，在細胞內均勻彌散分布，見圖2B，但數(shù)量較對照組增多，胞核較大;20 mg/L Rh2作用下，細胞體積增大，但核漿比明顯減小，F(xiàn)－actin 在細胞內分布均勻、規(guī)則，線條清晰，呈長束狀沿細胞長軸分布，見圖2C，表現(xiàn)出向正常細胞分化的跡象。

Figure 1. Cell cycle change and apoptosis of SMMC－772 cells after Rh2 treatment examined with flow cytometry.A:control group;B:10 mg/L group ;C:20 mg/L group;D:40 mg/L group;E:statistical graphic of apoptotic rate of SMMC－7721 cells. ±s.n=4. * P ＜0.05 vs 0(control)，10 mg/L and 20 mg/L groups.圖1 流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡率

Figure 2. Morphological changs of F－actin in SMMC－7721 cells treated with Rh2 for 4 days.A:control group(×40);B:10 mg/L group(×40);C:20 mg/L group(×20).圖2 人參皂苷Rh2 誘導SMMC－7721 細胞F－actin 形態(tài)及分布的改變

4 Rh2 對人肝癌細胞核基質－中間纖維系統(tǒng)的影響

經選擇性抽提的細胞去除了細胞膜系統(tǒng)、可溶性蛋白及微管、微絲等，但保留下了中間纖維和染色質。透射電鏡觀察表明對照組細胞核基質纖維數(shù)量較少、稀薄，分布不均勻;核纖層呈厚薄不一的致密結構，與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維均比較稀疏;中間纖維的單絲成份較少，多見以較粗短的束狀結構存在，排列分布不規(guī)則;經人參皂苷Rh2誘導后，SMMC－7721 細胞核骨架及與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維數(shù)量增多、相互交織;中間纖維單絲數(shù)量明顯增多，向四周發(fā)散直至細胞邊緣，并轉變?yōu)槔w細、較密的細絲狀連接尤以20 mg/L 組為明顯，其細胞核骨架－中間纖維系統(tǒng)中在總體形態(tài)上和正常細胞較相似，見圖3。

討 論

本研究中MTT 結果顯示，10 mg/L Rh2即能抑制SMMC－7721 細胞的生長，第6 d 抑制率為44.3%，而劑量為40 mg/L 時6 d 后的抑制率達88.3%，表明Rh2對SMMC－7721細胞的抑制作用具有時間和濃度依賴性;而流式細胞儀檢測也表明在作用4 d 后，40 mg/L 組的細胞凋亡率約為31.93%，明顯大于同期空白組、10 mg/L、20 mg/L 組，說明高濃度人參皂苷Rh2對SMMC－7721 細胞有明顯促凋亡作用，且也呈時間及劑量依賴。因此，隨著Rh2作用時間的延長、濃度的升高，對SMMC－7721 細胞的抑制及誘導凋亡作用增強。故選取抑制率適中的劑量和作用時間，設置空白對照組及實驗組(10、20 mg/L Rh2)，均培養(yǎng)4 d，以進一步研究Rh2對人肝癌細胞SMMC－7721 的細胞骨架的影響。

Figure 3. Morphological changes of the nuclear matrix－intermediate filament system induced by Rh2 at different concentrations. A:control (bar=5 μm);B:10 mg/L group (bar=2 μm);C:20 mg/L group(bar =10 μm);D:20 mg/L group(bar =2 μm).圖3 人參皂苷Rh2 誘導SMMC－7721 細胞核骨架－中間纖維系統(tǒng)的形態(tài)改變

共聚焦顯微鏡觀察結果表明，Rh2作用于SMMC－7721后可以使其細胞骨架F－actin 的形態(tài)、分布發(fā)生不同程度的改變。對照組的細胞微絲顯示紊亂，排列無序，數(shù)量較少且主要在胞膜周邊彌散分布，這可能主要與肌動蛋白側重于細胞的爬行擴散和遷移有關［5，6］;當Rh2濃度為10 mg/L 誘導細胞4 d 后，胞質中F－actin 分布增多并呈彌散分布;20 mg/L 的Rh2作用4 d 后，胞內F－actin 分布均勻、規(guī)則，單絲線條清晰，呈長束狀極性分布，與正常細胞內的F－actin 分布較為相似。表明所選濃度的Rh2可以使SMMC－7721 細胞的肌動蛋白絲分布向正常肝細胞的模式改變，通過肌動蛋白絲的解聚和重組，最后向接近正常細胞的微絲分布模式分化。

核基質－中間纖維系統(tǒng)是一種細胞內重要結構，其組分及其構型對某些細胞的增殖和分化具有重要影響，越來越多的研究表明該體系與細胞分化、基因表達調控密切相關，如核基質蛋白Satb2 對Hoxa2 的表達抑制在成骨細胞分化過程中扮演了重要的角色［7，8］。近年來，在對惡性腫瘤細胞的觀察中發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細胞與正常細胞相比，其核基質、核纖層、中間纖維的構型與正常細胞相比具有明顯差異［9］，如其核基質具有結構不規(guī)則、畸形等特征。本實驗通過整裝細胞電鏡技術，觀察誘導分化前后SMMC－7721 細胞核基質－中間纖維系統(tǒng)發(fā)現(xiàn):對照組細胞，細胞核基質纖維數(shù)量較少、稀薄，分布不均勻;核纖層呈厚薄不一的致密結構，與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維均比較稀疏;中間纖維的單絲成份較少，多見以較粗短的束狀結構存在，排列分布不規(guī)則，具有惡性腫瘤細胞核基質的構型特征;而經人參皂苷Rh2誘導后，SMMC－7721 細胞核骨架及與核纖層連接的核骨架纖維和中間纖維數(shù)量增多、相互交織;中間纖維單絲數(shù)量明顯增多，向四周發(fā)散直至細胞邊緣并轉變?yōu)槔w細、較密的細絲狀連接，尤以20 mg/L 組為明顯，其細胞核骨架－中間纖維系統(tǒng)中在總體形態(tài)上與正常細胞較相似。這表明Rh2對SMMC－7721 細胞產生了明顯的誘導分化作用，細胞核基質的這種向正常構型的恢復現(xiàn)象，是細胞惡性表型逆轉的一種重要形態(tài)特征和功能表現(xiàn)。

本研究表明人參皂苷Rh2能抑制SMMC－7721 細胞的增殖及誘導其凋亡作用，并呈劑量及時間依賴;同時能誘導SMMC－7721 細胞向正常肝細胞分化的作用，其誘導分化的作用機制可能與通過改變細胞骨架結構相關。但目前有關從細胞水平上研究腫瘤細胞中細胞骨架及核基質－中間纖維的構型變化與癌變的關系的報道還很少，有待進一步實驗研究。

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