中老年食蟹猴群體自發(fā)型糖尿病的篩選

萬玉玲, 張艷春, 彭白露 李學家 季 芳 靳麗莎 饒軍華 劉曉明

(1. 廣東藍島生物技術有限公司, 廣東 廣州 510555; 2. 廣東省昆蟲研究所, 廣東 廣州 510260)

中老年食蟹猴群體自發(fā)型糖尿病的篩選

萬玉玲1,#, 張艷春2,#, 彭白露1, 李學家2, 季 芳2, 靳麗莎2, 饒軍華1, 劉曉明1,2,*

(1. 廣東藍島生物技術有限公司, 廣東 廣州 510555; 2. 廣東省昆蟲研究所, 廣東 廣州 510260)

篩選440只中老年偏胖食蟹猴群體中自發(fā)糖尿病個體, 并探討食蟹猴群體中糖尿病粗篩的方法。以調查基礎血糖值為基礎, 推斷疑似糖尿病血糖值, 后經OGTT(口服糖耐量)和尿檢結果驗證該血糖值是否準確。結果顯示中老年偏胖食蟹猴群體血糖值為(3.88±0.98) mmol/L, 其中56只食蟹猴血糖值大于5.0 mmol/L, 被初步定為糖尿病個體。這些個體全部糖耐量異常, 且36只(69.23%)出現(xiàn)尿糖陽性, 證明血糖值大于5.0 mmol/L可作為本群體食蟹猴糖尿病的粗篩標準。由于針對中老年偏胖食蟹猴群體, 患病率為12.72% (56/440), 高于我國糖尿病患病率(9.7%)。雖然該實驗的糖尿病血糖指標并不適用于所有食蟹猴群體, 但是該篩選的流程簡單快捷, 對動物損傷小,可適用于大群體糖尿病的篩選。

自發(fā)性糖尿??；篩選；血糖；食蟹猴

隨著生活水平提高, 糖尿病成為全球性的重大疾病, 世界衛(wèi)生組織預計, 到2025年, 全球糖尿病患者人數(shù)將增至3億, 《新英格蘭醫(yī)學雜志》2010年研究數(shù)據(jù)表明, 我國總體患病率已達9.7%, 糖尿病前期的患病率高達15.5%(Yang et al, 2010)。因此,糖尿病藥物的研究開發(fā)已成為目前生物醫(yī)藥研究重點, 而適宜的糖尿病動物模型是深入研究糖尿病及其并發(fā)癥的基礎。

食蟹猴體型小巧，性情溫和, 與人類的遺傳物質具有高度的同源性, 在組織結構、 生理和代謝功能等方面顯示了許多與人類相似的特征, 成為目前應用最為廣泛的非人靈長類實驗動物(Wang et al,2007)。同時, 食蟹猴自發(fā)性糖尿病的發(fā)生情況也類似于人類, 發(fā)病前經歷胰島素抵抗、糖代謝異常、高胰島素血癥等階段, 并在其后代中也發(fā)現(xiàn)糖耐量異常等癥狀(Ramsey et al, 2000; Hotta et al, 2001;Wagner et al, 2001; Wagner et al, 2006)。此外, 食蟹猴與嚙齒類動物比，其生命周期長, 能夠充分地觀察和研究糖尿病動物的糖代謝、脂代謝、蛋白質代謝的異常和胰腺、肝臟、腎臟等組織的病理學改變以及由糖尿病引發(fā)的其他各種并發(fā)癥(Cefalu et al,2004; Slynkova et al, 2006), 因而, 它在研究糖尿病的發(fā)生、發(fā)展及防治等方面具有獨特的優(yōu)越性, 是進行糖尿病生物醫(yī)藥研究理想的模型。

本研究采用便攜式血糖儀對440只食蟹猴進行血糖值的調查基礎上, 結合OGTT及尿糖檢測結果確定糖尿病粗篩的指標, 對食蟹猴群糖尿病進行篩選, 篩選出的個體可應用于糖尿病的相關研究, 并通過本次研究, 建立一套食蟹猴群體糖尿病的快速篩選方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 8～24歲偏胖中老年食蟹猴共有440只, 其中雄性271只和雌性169只, 由廣東省昆蟲研究所華南靈長類動物研究開發(fā)中心提供。

1.1.2 試劑與儀器 氯胺酮, 購自沈陽市獸藥廠;便攜式血糖檢測儀, 美國強生, 穩(wěn)豪型血糖試紙;全自動生化檢測儀, 日立 7020; 拜耳尿液分析儀Clinitek Status, 德國BAYER, 滴寶干化學試尿液試紙條。

1.2 方法

1.2.1 實驗前動物預處理 將食蟹猴放置單籠靜止一周, 飲食、飲水照常供應, 記錄其日常飲食情況。于采血, 采尿檢測前一天開始禁食, 禁食時間保證在14～16 h之間。

1.2.2 血糖檢測及血清, 尿液采集 于凌晨6點左右, 采集食蟹猴尿液; 氯胺酮 5～10 mg/kg劑量對食蟹猴進行肌肉注射麻醉約10 min, 待實驗猴到完全喪失意識, 立即針刺后肢靜脈取血, 并用快速血糖儀檢測其血糖值。其中部分個體還需要后股靜脈取血 3 ml, 樣本室溫靜置 30 min后 4 ℃, 4 000 g/min離心10 min, 取上層血清用于生化檢測, 指標有丙氨酸氨基轉移酶(Alt)、谷草轉氨酶(Ast)、甘油三脂(TG)、膽固醇(CHO)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。

1.2.3 OGTT實驗 按4 g/kg體重的劑量(50%葡萄糖溶液)在2 min內鼻飼灌胃后, 分別在0、30、60和120 min共4個時間點針刺后肢靜脈取血, 用快速血糖儀測定血糖。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法 采用 Excel和SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析, 數(shù)據(jù)以x±S表示, 各組間差異比較采用單因素方差分析, 以P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 實驗結果

2.1 中老年食蟹猴群體血糖值調查

中老年偏胖食蟹猴群基礎血糖值為(3.88±0.98)mmol/L, 其中雄性食蟹猴的血糖值為(3.72±0.86)mmol/L, 雌性食蟹猴的血糖值為(4.14±1.11)mmol/L, 雌性血糖值是顯著高于雄性(表1)。

表1 中老年食蟹猴基礎血糖值(x±s)Tab. 1 Basal blood glucose of middle- and old-aged cynomolgus monkeys

根據(jù)中老年食蟹猴血糖值分布表 2顯示, 87%以上個體的血糖值分布低于5.0 mmol/L; 在血糖值大于5.0 mmol/L個體中, 雄性20只, 占雄性群體的7.38 %, 雌性36只, 占雌性群體的21.30 %; 大于10 mmol/L個體中, 雄性2只, 占雄性群體的0.74 %,雌性為4只, 占雌性群體的2.37 %, 雌性高血糖出現(xiàn)的比例明顯高于雄性。通過血糖值的調查, 初步假定血糖值大于5.0 mmol/L為糖尿病疑似個體, 共有56只食蟹猴為疑似糖尿病個體。

2.2 OGTT和尿糖實驗結果

對血糖值不同的 31只食蟹猴(血糖水平分布見表3)進行OGTT。圖1顯示不同血糖值的OGTT差異, 只有初始血糖值大于 5.0 mmol/L組, OGTT的2 h后血糖值仍然沒有下降的趨勢, 其余三組都存在不同程度的下降, 且初始血糖值最低組別(＜4.0 mmol/L), 下降最為明顯。結合尿檢結果（如表3）所示, 當初始血糖值小于4.0 mmol/L時, 不存在糖耐量異常, 且尿糖為陰性。當初始值位于 4.0～4.5 mmol/L之間時, 3/7個體糖耐量正常, 所有個體尿糖為陰性。當初始值位于4.5～5.0 mmol/L之間時,4/6個體糖尿量異常, 所有個體尿糖值仍為陰性。當初始值大于5.0 mmol/L以后, 所有的個體糖耐量都異常, 69.2%個體出現(xiàn)尿糖陽性。綜合OGTT, 尿檢和血糖值的調查結果, 可以定義血糖值大于 5.0 mmol/L為糖尿病個體, 確定疑似的56只食蟹猴為糖尿病個體。

表2 中老年食蟹猴血糖值調查表Tab. 2 Survey of blood glucose in middle- and old-aged cynomolgus monkeys

表3 不同血糖值對應的OGTT異常及尿糖陽性情況Tab. 3 Impaired glucose tolerance and positive urineglucose in different levels of blood glucose

圖1 不同血糖值的水平OGTTFig. 1 The OGTT corresponding to the different levels of blood glucose

2.3 生理生化值

根據(jù)上述結果, 把中老年食蟹猴群體分為糖尿病組和正常組, 對兩者常規(guī)生理生化值進行比較。從表4中可以看出, 只有TG和GLU存在差異, 其余各指標差異并不顯著。

表4 食蟹猴糖尿病組和正常組的基礎生理生化值的比較Tab. 4 Comparative analysis of basal blood physiology and biochemical values in the diabetes and normal cynomolgus monkeys

3 分 析

Wang et al (2007)測得食蟹猴空腹血糖值為(5.56±1.92) mmol/L, 雄性為(5.21±1.96) mmol/L,雌性為(5.94±1.85) mmol/L, 雌性血糖值高于雄性。Zhang et al (2005)測得食蟹猴血糖值為(3.67±1.5)mmol/L。Xu et al (2009)測得食蟹猴空腹血糖為(5.10士 1.89) mmol/L。本實驗排除極大值的影響外, 檢測得到中老年偏胖食蟹猴群體基礎血糖值范圍是(3.88±0.98) mmol/L, 雌性食蟹猴血糖值高于雄性。食蟹猴的基礎血糖值調查由于會受到種群的年齡(Wang et al, 2004)、檢測方法(Wen and Sun, 2003)、飼養(yǎng)方式，甚至取樣的時間(Zeng et al, 2010)等多種因素的影響, 因而還缺少統(tǒng)一的結論。因此, 不同食蟹猴群體進行糖尿病篩查的過程中, 應該以本群體的基礎血糖值作為背景參考, 推斷出適用于本群體糖尿病篩選的血糖值。本實驗的食蟹猴的基礎血糖值也只適合采用便攜式血糖儀檢測, 同時，針對中老年偏胖食蟹猴群體或具有類似特征群體。

2010年美國糖尿病協(xié)會制定的人類糖尿病診斷標準：HBA1C(糖化血紅蛋白)≥6.5%或空腹血糖≥7.0 mmol/L(126 mg/dL)或OGTT試驗2 h血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dL)或有高血糖的癥狀或高血糖危象, 且隨機血糖≥11.1 mmol/L(200 mg/dl)。對于非人靈長類動物糖尿病診斷標準, 尚缺少統(tǒng)一的結論。Leroith et al (2004)定義獼猴糖尿病血糖值為≥5.6 mmol/L, Xu et al (2009)參照猴的正?？崭寡侵?5.10±1.89) mmol/L, 定義≥8.0 mmol/L 為糖尿病診斷標準, Wanger et al (2006)根據(jù)食蟹猴的基礎血糖值低于人基礎血糖值 1～1.7 mmol/L, 推斷當食蟹猴的血糖值在5.5～7 mmol/L則極其可能為糖尿病, 同時也提出, 往往在血糖值還未達到這個值的時候, 就已出現(xiàn)了臨床癥狀。本研究在人工飼養(yǎng)條件下篩查中老年偏胖食蟹猴的糖尿病個體, 根據(jù)群體基礎血糖值推斷當血糖值大于 5.0 mmol/L為疑似糖尿病個體, 后經OGTT和尿糖結果進一步驗證該推斷可作為本群體食蟹猴糖尿病篩選標準。該血糖值診斷標準較其他研究偏低, 原因除群體基礎血糖偏低影響外, 還由于本實驗室采用便攜式血糖儀測得的食蟹猴血糖值較全自動生化分析儀測得結果低 0.5 mmol/L左右(本實驗室待發(fā)表的資料)。最終在群體中粗篩出糖尿病食蟹猴 56只, 比例為12.72%, 高于我國糖尿病患病率9.7%(Yang et al,2010), 也高于食蟹猴的糖尿病患率 3%(Wang et al, 2004), 主要是由于本研究針對中老年偏胖的群體, 該群體本身就是糖尿病的高危群體(Tigno et al,2004; Kavanagh et al, 2007)。

通過本研究, 粗篩的糖尿病食蟹猴可應用于醫(yī)學研究, 食蟹猴糖尿病的血糖值診斷標準可適用于具有相似特征的群體。除此之外, 本研究針對中老年的偏胖群體, 利用群體基礎血糖值推斷疑似的糖尿病血糖值, 后經 OGTT和尿糖結果驗證, 確定該群體糖尿病血糖值診斷標準, 粗篩糖尿病個體。該流程簡單快捷, 對動物損傷小, 可以應用到大規(guī)模群體篩查中。

致謝：本實驗在一線作業(yè)過程中, 得到了藍島公司生產一線同志們的大力幫助, 在此特別致謝！

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Screening of spontaneous diabetes mellitus in middle- and old-aged cynomolgus monkey

WAN Yu-Ling1,#, ZHANG Yan-Chun2,#, PENG Bai-Lu1, LI Xue-Jia2, JI Fang2,JIN Li-Sha2, RAO Jun-Hua1, LIU Xiao-Ming1,2,*

(1.Guangdong Landau Biotechnology Co. Ltd,Guangzhou510555,China; 2.Guangdong Entomological Institute,Guangzhou510260,China)

To screen spontaneous diabetic mellitus and explore methods for its rapid identification, the basal and inferred levels of blood glucose of 440 overweight, middle- and old-aged cynomolgus monkeys were analyzed.Diagnostic diabetes was further validated by the oral glucose tolerance test (OGTT) and urine glucose. The average level of blood glucose of these cynomolgus monkeys was (3.88±0.98) mmol/L, which was lower than the level for suspected diabetes (5.0 mmol/L). Of them, 56 (12.72%) monkeys were identified with levels of blood glucose greater than 5.0 mmol/L and diagnosed as the diabetic subjects. This population showed impaired glucose tolerance using the OGTT and 39 of the 56 (69.23%) had glucose positive urine. The methods for screening diabetic mellitus used in this study were simple, quick, and limited the harm to animals. However, the incidence of diabetes was higher in these tested monkeys than in the regular human population in China (9.7%), suggesting that these methods are useful for screening diabetic disease in a large population but not suitable for all cynomolgus monkeys.

Spontaneous diabetes mellitus; Screening; Blood glucose; Cynomolgus monkey

Q959.848； R587.2；R-332

A

0254-5853-(2011)03-0307-04

10.3724/SP.J.1141.2011.03307

2010-12-23；接受日期：2011-03-02

廣州市科技計劃項目 (2009A1-E051, 2010U1-E00811); 廣東省林業(yè)局項目 (2009KJCX016); 國家”十二五”項目(2011ZX09307-03-303)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: xemoonliu@hotmail.com

#并列第一作者(Authors contribute equally to the work)

萬玉玲(1979—), 女, 碩士, 研究方向：靈長類實驗動物學; 張艷春(1984—), 女, 碩士, 研究方向：實驗動物分子生物學