2個果梅品種雌蕊分化進程及相關生化指標分析

侍 婷，張其林，高志紅，章 鎮(zhèn)，莊維兵

（南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇 南京 210095）

果梅（Prunusmume Sieb.et Zucc.）原產(chǎn)中國，其果實營養(yǎng)豐富，主要用于加工果脯和梅酒等，具有凈血殺菌的作用，為“保健食品”，也是深受人們喜愛的休閑食品；研究結果表明：梅果實浸提液中的B－1成分具有抑制癌細胞增殖的功效［1］。在中國的廣東和云南等地民間都有用梅做菜的傳統(tǒng)；在日本，梅是佐餐的必需品，梅酒和飲料也很暢銷，因此，每年對梅果實的需求量很大；梅果實也是中國梅產(chǎn)區(qū)重要的出口創(chuàng)匯果品之一。但果梅產(chǎn)量偏低，嚴重制約了其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

造成果梅產(chǎn)量低的主要原因之一是花器官發(fā)育不良，主要表現(xiàn)為花器官中缺少雌蕊，形成空心花或子房枯萎、花柱短縮或彎曲、子房瘦小，這樣的畸形花統(tǒng)稱為不完全花（也稱為雌蕊敗育花）［2］。不完全花沒有受精能力，均于開放后脫落，造成雌蕊敗育。果樹雌性不育現(xiàn)象較為廣泛。芶劍英等［3］的研究結果表明：在果梅的子房形成和柱頭花芽形態(tài)分化結束時期，只能看到雄蕊性器官的形成并出現(xiàn)花粉粒，而雌蕊的性器官卻未形成，只能看到胚珠原始體，要形成成熟的胚囊還需要雌蕊內(nèi)部組織的進一步分化。Beppu等［4］認為：在甜櫻桃（Prunus avium L.）花芽由萼片原基向花瓣原基分化的過程中，若遭遇高溫則會導致雙雌蕊的發(fā)生。王宏國［5］的研究結果顯示：在龍眼（Dimocarpus longan Lour.）的花性別分化過程中，由于雌蕊和雄蕊發(fā)育至等長時，雄蕊迅速生長，雌蕊出現(xiàn)敗育并不斷萎縮，從而產(chǎn)生雄花；龍眼性別分化決定過程在萼片開裂前已經(jīng)完成。張小方［6］認為：文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge）雄花雌蕊的敗育屬于選擇性敗育，發(fā)生在大孢子母細胞減數(shù)分裂Ⅰ的雙線期。李勃等［7］認為：上海地區(qū)甜櫻桃畸形花量增多的原因可能與萼片原基向花瓣原基分化時遭遇7月底至8月初的高溫有關。也有一些學者對梅雌蕊發(fā)育及影響因素進行了初步研究，結果表明：在南京地區(qū)，10月上旬是雌蕊心皮原基分化高峰期，是梅雌蕊發(fā)育調(diào)控的關鍵時期［8－9］；影響梅雌蕊發(fā)育的主要因素有營養(yǎng)、植物激素和鈣調(diào)素水平［10－11］等；雌蕊原基分化期梅雌蕊畸形率明顯低于花期，說明梅的不完全花可能主要是在雌蕊結構分化期由于雌蕊發(fā)育異常而形成的［8］。王珊等［12－13］利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術在果梅開花期鑒定出4個差異表達蛋白，這些蛋白質(zhì)與糖代謝、淀粉代謝以及光合作用有關。但根據(jù)現(xiàn)有研究資料還不能完全說明造成果梅雌蕊敗育的原因以及敗育的關鍵時期。

鑒于此，作者采用石蠟切片法對果梅品種‘龍眼’和‘大嵌蒂’雌蕊發(fā)育過程中花芽的縱切面解剖結構進行了比較觀察，并對完全花和不完全花的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及淀粉含量進行了測定分析，旨在尋找果梅雌蕊敗育的關鍵時期、比較不完全花的生理指標差異，以期為進一步揭示果梅雌蕊敗育機制提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的果梅品種‘龍眼’和‘大嵌蒂’均為株齡5 a以上的實生苗，以株距4 m、行距5 m栽植于南京農(nóng)業(yè)大學國家果梅種質(zhì)資源圃，采取常規(guī)栽培管理方法。分別于2009年10月至2010年3月和2010年10月至2011年3月進行2次實驗，數(shù)據(jù)為2次實驗的平均值。

1.2 方法

1.2.1 花器官質(zhì)量調(diào)查 參照文獻［9］的方法對果梅雌蕊發(fā)育時期進行劃分，分別在12月初（雌蕊分化期）、12月末（雌蕊分化末期）及3月初（盛花期）對2個供試品種的花器官質(zhì)量進行調(diào)查。采集短枝上的花，觀察雌蕊發(fā)育狀況，統(tǒng)計各類型花朵數(shù)，計算完全花、不完全花（空心花和花柱不發(fā)育花）的比例，每個時期每個品種隨機觀察200朵花，重復3次。

1.2.2 花芽形態(tài)及縱切面解剖結構觀察 從10月初開始每隔7d取樣1次，12月開始每隔2 d取樣1次，直至開花。隨機從短枝上采集30個大小一致的花芽，用游標卡尺對花芽縱徑及橫徑進行測量。

采用常規(guī)石蠟切片法［14］制片?；ㄑ肯扔肍AA固定液固定24 h，經(jīng)乙醇和二甲苯系列梯度脫水后用石蠟進行包埋，切片厚度10μm，鐵礬蘇木精染色；用Axio Lab A1 MAT顯微鏡（德國卡爾·蔡司公司生產(chǎn)）觀察拍照。雌蕊分化時期參照李勃等［7］的方法劃分為未分化期、分化初期、分化期和分化末期。

1.2.3 生化指標測定 在確定雌蕊敗育發(fā)生時期后，取敗育發(fā)生期‘龍眼’的完全花、‘大嵌蒂’的完全花和不完全花各10 g，液氮中研磨后，測定分析可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和淀粉含量，重復3次測定，結果取平均值。參照文獻［15］，采用MDA法測定可溶性糖含量、采用考馬斯亮藍G－250法測定可溶性蛋白質(zhì)含量、采用蒽酮比色法測定淀粉含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel2003軟件進行標準差分析；采用SPSS18.0軟件進行方差分析。

2 結果和分析

2.1 花器官發(fā)育狀況分析

雌蕊分化時期不同階段2個果梅品種的不完全花比例見表1。由表1可知：各個階段品種‘龍眼’的不完全花比例遠低于品種‘大嵌蒂’；隨著雌蕊分化的進行，不完全花比例顯著增加。從雌蕊分化期到雌蕊分化末期，品種‘大嵌蒂’不完全花比例由56.0％增加至67.9％，盛花期時增加至76.3％；而品種‘龍眼’的不完全花比例也由雌蕊分化期的3.2％增加至盛花期的5.0％。顯示雌蕊分化期果梅雌蕊畸形率遠低于盛花期，說明果梅的不完全花可能主要是在雌蕊分化過程中由于雌蕊發(fā)育異常而形成的。

表1 雌蕊發(fā)育不同階段2個果梅品種不完全花比例的比較1）Table1 Comparison of imperfect flower rate between two cultivars of Prunusmume Sieb.et Zucc.at different stages of pistil development1）

2.2 雌蕊分化進程分析

雌蕊分化進程中果梅品種‘龍眼’和‘大嵌蒂’花芽縱切面的解剖結構變化見圖1。從9月30日至3月11日2個品種處于雌蕊分化不同階段的花芽百分率見表2；花芽的縱徑和橫徑的測定結果見表3。

由圖1和表2可見：品種‘龍眼’的雌蕊未分化期大約在9月底，此時期雌蕊原基還沒有萌動，萼片及花瓣分化已經(jīng)較為完整，雄蕊處于分化過程中（圖1－1）；雌蕊分化初期約在10月中下旬，此時期雌蕊原基開始萌動（圖1－2）；11月下旬至12月上旬進入雌蕊分化期（圖1－3），雌蕊原基細胞分裂旺盛，同時分化成花柱和柱頭；最后在雌蕊分化末期（即12月中旬以后）開始胚珠的分化（圖1－4），至此，品種‘龍眼’的雌蕊分化基本完成，形成具有雄蕊和雌蕊的完全花。在品種‘大嵌蒂’雌蕊分化過程中，前、中期與品種‘龍眼’雌蕊分化進程基本一致，均經(jīng)歷了雌蕊未分化期、分化初期和分化期（圖1－5～7）；但進入分化期的約65％的花芽（表2），在分化期停留了近3個月（11月至翌年1月）卻沒有進行相應的伸長生長，而是保留最初的發(fā)育狀況；然而到了2月份以后，已經(jīng)分化出的雌蕊最終發(fā)生解體，此時期為解體期（圖1－8），細胞界限開始變得不明顯，此時雌蕊可能發(fā)生了選擇性敗育；此后，進入解體后修復期（圖1－9），此時期雄蕊正常發(fā)育，最終產(chǎn)生成熟的花粉粒（圖1－10）。

由表2還可見：10月中上旬，雌蕊原基開始分化，品種‘龍眼’與‘大嵌蒂’分別有71.6％和68.6％的花芽進入了雌蕊分化初期；10月中下旬以后，2個品種的花芽陸續(xù)進入雌蕊分化期，此時期，品種‘龍眼’只有2.3％的花芽繼續(xù)停留在雌蕊未分化期，而品種‘大嵌蒂’仍有20.0％的花芽沒有進入雌蕊分化期；同時，2個品種花芽的縱徑和橫徑在10月份均有所增加，且品種‘大嵌蒂’花芽的縱徑和橫徑均大于品種‘龍眼’（表3）。在隨后的4周時間里，品種‘龍眼’有90.9％的花芽進入了雌蕊分化期，同時有2.0％的花芽進入了雌蕊分化末期，分化進程較為整齊；而此時品種‘大嵌蒂’只有59.4％的花芽進入了雌蕊分化期，分化進程呈現(xiàn)多樣化，且2個品種花芽橫徑均增加顯著，但品種‘大嵌蒂’花芽縱徑和橫徑逐漸小于品種‘龍眼’。12月份，品種‘龍眼’的雌蕊分化較為旺盛，接近98％的花芽進入了雌蕊分化末期，花芽的縱徑和橫徑逐漸增加；此月份，品種‘大嵌蒂’的多數(shù)花芽仍處于雌蕊分化期，并且12月10日（2009年為12月4日）測量的花芽縱徑和橫徑分別為0.40和0.28 cm，且整個12月份花芽橫徑變化幅度較小，雌蕊發(fā)育基本停滯在雌蕊分化期，雌蕊大小約為0.03～0.05 cm，另外約有25％的花芽進入了雌蕊分化末期，順利完成雌蕊分化過程。在1月份至3月份的盛花期，品種‘龍眼’的絕大多數(shù)花芽順利完成雌蕊分化過程，僅有1.3％的花芽仍然沒有進行雌蕊分化；品種‘大嵌蒂’有66％以上的花芽停留在雌蕊分化期，且進入2月份后，原本停留在分化期的雌蕊幾乎全部解體，但在1月底至2月上旬期間，品種‘大嵌蒂’花芽縱徑增加顯著（表3）。

圖1 雌蕊分化期2個果梅品種花芽縱切面解剖結構Fig.1 Anatom ical structure of longitudinal section of flower bud of two cultivars of Prunusmume Sieb.et Zucc.during pistil differentiation peroid

表2 不同測定日期2個果梅品種處于雌蕊分化不同階段的花芽百分率1）Table2 Percentage of flower bud at different stages of pistil differentiation of two cultivars of Prunus mume Sieb.et Zucc.at different determ ination dates1）

2.3 花的生化指標分析

由于果梅品種‘龍眼’不完全花的比例極低（5％以下），而品種‘大嵌蒂’不完全花比例較高（56％～76％），因此，為比較果梅不完全花與完全花的生化指標差異，對品種‘龍眼’的完全花及品種‘大嵌蒂’完全花和不完全花中的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)及淀粉含量進行了分析，結果見表4。

由表4可見：品種‘龍眼’完全花中的可溶性糖含量最高，為3.70 mmol·L－1；品種‘大嵌蒂’不完全花中的可溶性糖含量最低，為3.02 mmol·L－1。2個品種完全花的可溶性糖含量接近，差異不顯著；而2個品種完全花的可溶性糖含量與品種‘大嵌蒂’不完全花之間均有顯著差異。品種‘龍眼’完全花中可溶性

表3 不同測定日期2個果梅品種花芽縱徑和橫徑的比較（±SD）Table3 Com parison of longitudinal and horizontal diameters of flower bud of two cultivars of Prunusmume Sieb.et Zucc.at different determ ination dates（±SD）

表3 不同測定日期2個果梅品種花芽縱徑和橫徑的比較（±SD）Table3 Com parison of longitudinal and horizontal diameters of flower bud of two cultivars of Prunusmume Sieb.et Zucc.at different determ ination dates（±SD）

日期Date（MM－DD）縱徑/cm Longitudinal diameter龍眼Longyan 大嵌蒂Daqiandi橫徑/cm Horizontal diameter龍眼Longyan 大嵌蒂Daqiandi09－30 0.12±0.01 0.16±0.01 0.07±0.00 0.09±0.0210－15 0.15±0.01 0.18±0.00 0.10±0.02 0.12±0.0110－29 0.16±0.02 0.20±0.02 0.12±0.01 0.15±0.0111－26 0.32±0.02 0.36±0.03 0.24±0.03 0.24±0.0312－03 0.40±0.01 0.36±0.09 0.28±0.06 0.24±0.0212－10 0.48±0.02 0.40±0.02 0.36±0.02 0.28±0.0712－17 0.60±0.03 0.44±0.01 0.40±0.01 0.28±0.0212－24 0.60±0.12 0.48±0.02 0.44±0.02 0.28±0.0412－31 0.60±0.08 0.52±0.00 0.52±0.11 0.30±0.0201－14 0.63±0.03 0.56±0.01 0.52±0.03 0.34±0.0801－28 0.68±0.11 0.60±0.03 0.55±0.02 0.36±0.0102－11 0.75±0.06 0.69±0.07 0.57±0.10 0.36±0.1502－25 0.80±0.15 0.78±0.02 0.62±0.02 0.44±0.02

表4 2個果梅品種完全花和不完全花中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和淀粉含量的比較1）Table4 Comparison of contents of soluble sugar，soluble protein and starch in perfect and imperfect flowers of two cultivars of Prunusmume Sieb.et Zucc.1）

3 討論和結論

果梅品種‘龍眼’原產(chǎn)于福建永泰，為南方品種，其花期早于原產(chǎn)江蘇吳縣的品種‘大嵌蒂’［2］。在雌蕊分化過程中，品種‘龍眼’的雌蕊分化稍早于品種‘大嵌蒂’，且分化進程穩(wěn)定而快速；12月10日，品種‘龍眼’已有85.5％的花芽進入雌蕊分化末期，而品種‘大嵌蒂’只有23.2％的花芽進入雌蕊分化末期，并且進入雌蕊分化末期后形成完全花的花芽數(shù)量一直停留在25％左右。在12月份的1個月時間內(nèi)，品種‘大嵌蒂’花芽橫徑幾乎沒有增加，雌蕊的發(fā)育也一直停留在雌蕊分化期；1月份，其花芽橫徑有所增加，但較早期花芽分化增幅仍較?。贿M入2月份，伴隨雌蕊的解體及營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，花芽橫徑顯著增加。果梅萼片原基向花瓣原基分化的時期為8月中下旬至9月上旬［2］，此時南京氣溫較高，高溫有可能導致果梅雌蕊發(fā)育異常。果梅雌蕊敗育發(fā)生于雌蕊分化過程中，推測應屬于選擇性敗育。在品種‘大嵌蒂’花芽分化過程中產(chǎn)生了大量的雌蕊敗育花，并通過敗育的雌蕊對養(yǎng)分進行重新分配和利用，為同一朵花的其他組織提供物質(zhì)和能量。

徐漢卿等［8］對梅樹花芽組織和細胞中主要營養(yǎng)物質(zhì)的積累及分布進行了組織化學研究，結果顯示：蛋白質(zhì)多分布于花原基、花器各部原基、造孢組織、花粉母細胞和單胞花粉粒中；而淀粉粒在這些部位卻無分布，只存在于芽的基部、遠離生長錐的部位，或陸續(xù)出現(xiàn)于由原基伸長而形成的幼小萼片和花瓣中；發(fā)育中的雄蕊和雌蕊則要到單胞花粉粒和胚囊出現(xiàn)時才有淀粉貯積的反應。張小方［6］的研究結果顯示：隨著文冠果雌蕊敗育的發(fā)生，雄花的雌蕊組織中沒有出現(xiàn)淀粉粒且蛋白質(zhì)含量逐漸下降，由此推測營養(yǎng)不足是影響文冠果雌蕊敗育的重要原因之一；在雄花雌蕊敗蛋白質(zhì)含量最高，為2.12 mg·g－1；品種‘大嵌蒂’不完全花中可溶性蛋白質(zhì)含量最低，僅1.31 mg·g－1；品種‘大嵌蒂’完全花的可溶性蛋白質(zhì)含量高于其不完全花，但低于品種‘龍眼’的完全花，三者間存在顯著差異。品種‘龍眼’完全花的淀粉含量最低，僅為8.87％，與品種‘大嵌蒂’完全花的淀粉含量（9.23％）無顯著差異；而品種‘大嵌蒂’不完全花的淀粉含量最高，達9.71％，與2個品種完全花的淀粉含量有顯著差異。

綜合分析可見：品種‘龍眼’完全花的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量均高于‘大嵌蒂’的完全花和不完全花，而淀粉含量則低于‘大嵌蒂’的完全花和不完全花；而在3個供試樣品中，‘大嵌蒂’不完全花的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量均低于2個品種的完全花，淀粉含量則高于2個品種的完全花。育前夕和敗育的胚珠細胞中均出現(xiàn)核仁分解、染色質(zhì)凝集且邊緣化現(xiàn)象，屬于典型的細胞程序性死亡。在果梅的完全花中，3－磷酸甘油醛脫氫酶含量升高，推測與雌蕊發(fā)育需要更多的能量以及糖酵解和三羧酸循環(huán)加強有關；α－半乳糖激酶參與半乳糖的降解，在完全花小蕾期該酶的含量小于不完全花，推測雌蕊發(fā)育的前期需要糖的積累［12－13］。

王珊［13］認為：在果梅完全花發(fā)育后期尿苷二磷酸葡糖醛酸脫氫酶（UDPase）含量低于不完全花。UDPase具有促進碳水化合物的生物合成、使蔗糖轉(zhuǎn)化為淀粉的作用。本實驗對雌蕊敗育發(fā)生時‘大嵌蒂’不完全花和完全花以及‘龍眼’完全花的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和淀粉含量進行了測定分析。結果表明：果梅品種‘龍眼’和‘大嵌蒂’完全花的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量均高于‘大嵌蒂’不完全花，淀粉含量顯著低于‘大嵌蒂’不完全花，推測這可能與UDPase含量的變化有關。

綜合分析結果表明：2個果梅品種完全花的可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量均高于不完全花、淀粉含量低于不完全花，而品種‘大嵌蒂’的不完全花比例遠高于品種‘龍眼’，推測品種‘大嵌蒂’不完全花比例高的原因可能是由于淀粉及其他大分子物質(zhì)不能及時轉(zhuǎn)化為可溶性的小分子物質(zhì)，從而無法被雌蕊的其他分化組織吸收利用，導致雌蕊的選擇性敗育。但是，由于可溶性糖及淀粉代謝均屬于動態(tài)反應，酶與各時期底物及生成物的量均處于動態(tài)變化中，不能簡單地根據(jù)酶活性及淀粉等物質(zhì)的含量確定雌蕊敗育的真正原因。溫度、光照、營養(yǎng)條件等外在因素在果梅花芽分化過程中均起著重要的作用，因而，引起果梅雌蕊敗育的主導因素是什么?還需要結合果枝生長習性、物候期等進行進一步研究。

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