鄭金雙，張蜀寧，孫成振，王雅美

不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）又稱小白菜，北方稱油菜，為中國(guó)南方栽培面積最大、最大眾化的蔬菜作物。目前在蔬菜作物生產(chǎn)應(yīng)用中，多倍體僅見西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.） Mansf.〕［1］和不結(jié)球白菜［2］，其遺傳性狀穩(wěn)定性、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)以及農(nóng)藝性狀均優(yōu)于二倍體。對(duì)不結(jié)球白菜的生理代謝［3］、基因表達(dá)［4-5］等方面的研究已有報(bào)道，但細(xì)胞學(xué)方面的研究較為薄弱，主要原因在于其體細(xì)胞染色體小、制片難度大。目前僅見二倍體不結(jié)球白菜核型［6］及未減數(shù)2n配子的相關(guān)研究報(bào)道［7］，關(guān)于二倍體不結(jié)球白菜及其同源四倍體細(xì)胞有絲分裂的觀察未見報(bào)道。

在十字花科（Cruciferae）植物的體細(xì)胞染色體制片過程中，常用的預(yù)處理劑是8-羥基喹啉［8］。目前用于植物體細(xì)胞染色體制片的預(yù)處理劑有多種，因而，也有研究者將不同的預(yù)處理劑用于十字花科植物體細(xì)胞染色體的研究，并獲得了不同的預(yù)處理效果［9-11］。為了更有效地研究不結(jié)球白菜體細(xì)胞染色體形態(tài)，作者以二倍體不結(jié)球白菜根尖為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其體細(xì)胞染色體制片條件進(jìn)行了摸索；在此基礎(chǔ)上，對(duì)二倍體及四倍體不結(jié)球白菜根尖體細(xì)胞的有絲分裂過程進(jìn)行了觀察，以期為不結(jié)球白菜及十字花科等小染色體植物的遺傳進(jìn)化、變異與基因定位研究提供必要的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的二倍體不結(jié)球白菜品種‘10P15’及同源四倍體不結(jié)球白菜品種‘10P11’種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片條件篩選 種子于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，待大部分根的長(zhǎng)度約1.5 cm時(shí)于4℃冰箱中過夜，取出后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～2 h，分別在根長(zhǎng)小于0.5 cm、0.5～1.0 cm、1.0～2.0 cm及大于2.0 cm時(shí)取根尖，根尖長(zhǎng)度1～2 mm，每個(gè)長(zhǎng)度等級(jí)的根各取10條，重復(fù)取樣3次，用20 mg·L-1放線菌酮溶液預(yù)處理2.0 h。

取長(zhǎng)1.0～2.0 cm根的根尖，每處理50～80條，分別用2種方法進(jìn)行預(yù)處理。方法一：將根尖置于蒸餾水中，于4℃冰箱中用冰水混合物分別冰凍處理21、22、23和24 h；方法二：將根尖置于7種預(yù)處理劑中分別預(yù)處理，以0.5 h為1個(gè)時(shí)間梯度。其中，在2 mmol·L-18-羥基喹啉溶液或2 mmol·L-18-羥基喹啉與質(zhì)量濃度0.2 g·L-1秋水仙素等體積混合液中分別預(yù)處理1.5～3.5 h；在質(zhì)量濃度0.2 g·L-1秋水仙素溶液中分別預(yù)處理1.5～3.0 h；在飽和對(duì)二氯苯溶液中分別預(yù)處理1.0～3.0 h；在質(zhì)量濃度20或40 mg·L-1放線菌酮溶液或質(zhì)量濃度40 mg·L-1放線菌酮與2mmol·L-18-羥基喹啉等體積混合液中分別預(yù)處理2.0～3.5 h。

經(jīng)上述預(yù)處理的根尖用卡諾固定液〔V（無水乙醇）∶V（冰乙酸）=3∶1〕固定24 h，用0.075 mol·L-1KCl前低滲30min，然后用1 mol·L-1HCl于60℃解離約8 min，用蒸餾水后低滲10 min，卡寶染液染色約7 min，烤片及壓片后，分別選10張具有代表性的制片，用Zeiss AX41顯微鏡于40倍鏡下觀察并在100倍鏡下拍照；選10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)細(xì)胞總數(shù)和中期分裂相數(shù)，并計(jì)算中期分裂相占細(xì)胞總數(shù)的百分率。

1.2.2 體細(xì)胞染色體有絲分裂過程觀察 按上述條件催芽，待二倍體和四倍體不結(jié)球白菜根的長(zhǎng)度為1.0～2.0 cm時(shí)分別取長(zhǎng)度1～2 mm根尖，根據(jù)篩選出的制片條件，用質(zhì)量濃度20 mg·L-1放線菌酮溶液預(yù)處理2.5～3.0 h，換卡諾固定液固定24 h后，用0.075 mol·L-1KCl前低滲30min，然后用1 mol·L-1HCl于60℃解離約8 min，蒸餾水后低滲10 min，卡寶染液染色約7min，烤片及壓片后，用Zeiss AX41顯微鏡于40倍鏡下觀察并在100倍鏡下拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 不結(jié)球白菜體細(xì)胞染色體制片條件分析

在不結(jié)球白菜根尖體細(xì)胞染色體制片過程中，分別選取長(zhǎng)度小于0.5 cm、0.5～1.0 cm、1.0～2.0 cm和大于2.0 cm的根取根尖，獲得的分裂相數(shù)目有明顯差異。取樣時(shí)根長(zhǎng)度為1.0～2.0 cm，獲得的分裂相數(shù)目相對(duì)較多，占細(xì)胞總數(shù)的64.75％，為根長(zhǎng)小于0.5 cm和大于2.0 cm處理組的1.38和98.11倍。因而，根長(zhǎng)度為1.0～2.0 cm對(duì)不結(jié)球白菜根尖體細(xì)胞染色體制片較為適宜。這一結(jié)果與張紅梅等［12］的研究結(jié)果一致。

采用冰凍方法進(jìn)行預(yù)處理，不同處理時(shí)間對(duì)分裂相的數(shù)量有明顯影響。冰凍時(shí)間為22～23 h，獲得的分裂相數(shù)量相對(duì)較多，占細(xì)胞總數(shù)的30.20％，分別是冰凍處理21和24 h的1.52和1.55倍。

圖1 用不同預(yù)處理劑預(yù)處理后二倍體不結(jié)球白菜根尖中期染色體形態(tài)Fig.1 Chromosome morphology of metaphase in root-tip of diploid of non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）pretreated by different pretreatment agents

采用7種不同預(yù)處理劑對(duì)二倍體不結(jié)球白菜根尖細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)處理，對(duì)分裂相的數(shù)量及染色體形態(tài)有明顯的影響，各處理組中期染色體形態(tài)見圖1，中期分裂相百分率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。用2 mmol·L-18-羥基喹啉預(yù)處理3.0～3.5 h，獲得的中期分裂相適合染色體核型分析；預(yù)處理3.0 h，獲得的的中期分裂相數(shù)目較多，占細(xì)胞總數(shù)的46.82％。用質(zhì)量濃度0.2 g·L-1秋水仙素預(yù)處理2.5 h，獲得的中期分裂相適合染色體核型分析；預(yù)處理1.5 h，獲得的中期分裂相適合染色體分帶研究；而預(yù)處理2.5 h，獲得的中期分裂相數(shù)目較多，占細(xì)胞總數(shù)的57.32％。用飽和對(duì)二氯苯預(yù)處理1.5～2.0 h，獲得的中期分裂相適合染色體核型分析；預(yù)處理1.0 h，獲得的中期分裂相數(shù)目較多，占細(xì)胞總數(shù)的40.84％。用20 mg·L-1放線菌酮溶液預(yù)處理2.5～3.0 h，獲得的中期分裂相適宜于染色體核型分析；預(yù)處理2.0 h，獲得的中期分裂相則適宜于染色體分帶研究；而預(yù)處理3.5 h，獲得的中期分裂相數(shù)目較多，占細(xì)胞總數(shù)的53.65％。用40 mg·L-1放線菌酮溶液進(jìn)行預(yù)處理，易導(dǎo)致染色體加倍，不利于分析。用40 mg·L-1放線菌酮與2 mmol·L-18-羥基喹啉等體積混合液預(yù)處理3 h，獲得的中期分裂相適宜于染色體核型分析；預(yù)處理1.5～2.5 h，獲得的中期分裂相適宜于染色體分帶研究；而預(yù)處理2.0 h，獲得的中期分裂相數(shù)目較多，占細(xì)胞總數(shù)的65.40％。用2 mmol·L-18-羥基喹啉與0.2 g·L-1秋水仙素等體積混合溶液預(yù)處理2.5 h，獲得的中期分裂相適宜于染色體核型分析；預(yù)處理1.5～2.0 h，獲得的中期分裂相適宜于染色體分帶研究；而預(yù)處理2.5 h，獲得的中期分裂相數(shù)目較多，占細(xì)胞總數(shù)的43.18％。

表1 用不同預(yù)處理劑預(yù)處理后二倍體不結(jié)球白菜根尖中期分裂相的百分率Table1 Percentage of sp lit phase of metaphase in root-tip of dip loid of non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）pretreated by different pretreatment agents

2.2 二倍體和四倍體不結(jié)球白菜體細(xì)胞有絲分裂過程觀察

二倍體和四倍體不結(jié)球白菜根尖體細(xì)胞有絲分裂過程的觀察結(jié)果見圖2。由圖2可見：二倍體和四倍體不結(jié)球白菜體細(xì)胞有絲分裂行為相似。在間期（圖2-1，13），染色質(zhì)沒有高度螺旋化形成染色體，而是以染色質(zhì)的形式進(jìn)行DNA單鏈復(fù)制；在前期，染色體螺旋化縮短變粗（圖2-2～4，14～16）；在中期，染色體著絲點(diǎn)排列在赤道板上，紡錘絲附著在著絲點(diǎn)上，染色體濃縮變粗（圖2-5，6，17，18），顯示出不結(jié)球白菜特有的染色體數(shù)目和形態(tài)；在后期，著絲點(diǎn)一分為二，每條染色體的2條姊妹染色單體分開并移向兩極，同一細(xì)胞內(nèi)的各條染色體都以基本相同的速率同步移向兩極（圖2-7～9，19～21）；在末期，染色體到達(dá)細(xì)胞兩極（圖2-10，11，22），1個(gè)母細(xì)胞分裂成2個(gè)子細(xì)胞（圖2-12，23），染色體解螺旋，進(jìn)入下一次有絲分裂。

由圖2還可見：四倍體不結(jié)球白菜體細(xì)胞在分裂過程中還會(huì)出現(xiàn)一些異?，F(xiàn)象。體細(xì)胞染色體配對(duì)成二價(jià)體及多價(jià)體（圖2-24中箭頭所示），同一細(xì)胞中2條或3條染色體部分配對(duì)成二價(jià)體或三價(jià)體；有些細(xì)胞有絲分裂后期出現(xiàn)染色體橋（圖2-25），并產(chǎn)生落后染色體（圖2-26）；正常的有絲分裂過程中，后期染色體會(huì)分向兩極，而當(dāng)染色體異常分裂時(shí)，后期染色體會(huì)被不均等的拉向二極、三極甚至四極（圖2-27～29）；四倍體染色體數(shù)目為2n=40，但個(gè)別細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)著絲粒未分裂的現(xiàn)象，即內(nèi)源有絲分裂（圖2-30）。

3 討論和結(jié)論

對(duì)植物體細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)、核型分析、外源染色體鑒定（染色體分帶和染色體原位雜交等）、染色體的分組和分離，都需要有一定數(shù)量處于有絲分裂中期的細(xì)胞才易于進(jìn)行［13］。理論上，任何時(shí)間取樣都可以從正常生長(zhǎng)的根尖分生組織部位獲得中期分裂相［14］。但如果分裂相很少，就會(huì)阻礙進(jìn)一步的核型分析、分帶研究以及原位雜交等相關(guān)研究。李懋學(xué)等［15］認(rèn)為：對(duì)小染色體植物進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖儨靥幚砜稍黾臃至严?，預(yù)處理是染色體制備的關(guān)鍵步驟之一。本研究結(jié)果表明：選取長(zhǎng)度1.0～2.0 cm根的根尖，分裂相數(shù)目較多。采用冰凍預(yù)處理22～23 h，也能獲得一定量的分裂相，但均少于采用不同預(yù)處理劑獲得的分裂相數(shù)量。用2 mmol·L-18-羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理，染色體長(zhǎng)度較短，只適用于核型分析及計(jì)數(shù)；用質(zhì)量濃度0.2 g·L-1秋水仙素、質(zhì)量濃度40 mg·L-1放線菌酮與2 mmol·L-18-羥基喹啉等體積混合溶液以及2 mmol·L-18-羥基喹啉與0.2 g·L-1秋水仙素等體積混合溶液進(jìn)行預(yù)處理，染色體相對(duì)較長(zhǎng)，僅適用于染色體計(jì)數(shù)和核型分析；用飽和對(duì)二氯苯或質(zhì)量濃度20 mg·L-1放線菌酮進(jìn)行預(yù)處理，染色體較長(zhǎng)，著絲點(diǎn)及隨體也最清晰，其中用質(zhì)量濃度20 mg·L-1放線菌酮進(jìn)行預(yù)處理，獲得的分裂相數(shù)目較多。根據(jù)比較結(jié)果，在進(jìn)行不結(jié)球白菜體細(xì)胞染色體有絲分裂觀察研究時(shí)，取樣時(shí)根長(zhǎng)以1.0～2.0 cm為宜，最適宜的預(yù)處理方法是用質(zhì)量濃度20 mg·L-1放線菌酮浸泡2.0～3.0 h。

同源四倍體不結(jié)球白菜有絲分裂行為與二倍體相似，但在四倍體的體細(xì)胞有絲分裂過程中存在異?，F(xiàn)象，如細(xì)胞分裂異常、內(nèi)源有絲分裂等；此外還偶見染色體數(shù)目異常，2n=24～67，多集中于2n=36～44，占細(xì)胞總數(shù)的12％，小于2n=36的占3％，大于2n=44的占0.4％，這種異常現(xiàn)象可能是體細(xì)胞分裂異常及內(nèi)源有絲分裂造成的。張紅梅等［16］認(rèn)為：四倍體有絲分裂異常可能是由于染色體加倍打破了二倍體中各種固有的平衡，造成內(nèi)源激素不協(xié)調(diào)和生理生化過程不正常等。一般認(rèn)為，端粒融合和染色體結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是促使體細(xì)胞染色體配對(duì)的主要原因［17］。Stebbins［18］認(rèn)為：同源四倍體染色體加倍造成特定基因位點(diǎn)純合，隱性基因控制性狀，以及不正常分離。而四倍體不結(jié)球白菜體細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生異?，F(xiàn)象的具體原因尚有待進(jìn)一步研究。

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