王玉娟,房經(jīng)貴,①,于華平,汪詩(shī)珊,李曉穎,陳翔高

梅 (PrunusmumeSieb.et Zucc.)為薔薇科(Rosaceae)李屬 (PrunusL.)植物,系中國(guó)主產(chǎn)的傳統(tǒng)名花佳果。梅在中國(guó)已有 7 000年以上的應(yīng)用歷史,栽培歷史也有 3 000年以上[1-3]。根據(jù)主要用途的不同,可將梅分為果梅與花梅 (梅花)2種類型[3-4]。果梅雌蕊發(fā)育充實(shí),多能正常受精結(jié)實(shí),產(chǎn)量較高,花瓣以單瓣為主；花梅的大部分品種雌蕊發(fā)育較差,花粉量少,花芽萌發(fā)率低,一般不能大量結(jié)實(shí)或果實(shí)品質(zhì)較差,但仍有部分花梅品種能正常受精結(jié)實(shí)。例如,現(xiàn)今很多的江梅品種仍保留著結(jié)果的習(xí)性,成為既有觀花價(jià)值又有食用價(jià)值的花果兼用梅。

相關(guān)資料表明[5]：花梅是從果梅或野梅演化而來(lái)的,而且,花梅的實(shí)生選種以及雜交育種也是以果梅為材料。在植物分類系統(tǒng)中花梅與果梅都屬于同一類群,并沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步區(qū)分。L i等[6]和 Hayashi等[7]曾分別利用 SNP和 SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)花梅和果梅進(jìn)行研究,并都得出這 2類梅在遺傳上是同一種植物的結(jié)論。它們的區(qū)別主要是花器官的形態(tài)差異與利用目的的不同,花梅與果梅是栽培過(guò)程中依據(jù)不同的園藝性狀得出的分類結(jié)果。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工選育栽培,花梅與果梅形成了品種繁多、表型性狀豐富、遺傳進(jìn)化關(guān)系復(fù)雜的重要植物類群。

盡管在實(shí)際利用與研究中有花梅與果梅之分,但是由于長(zhǎng)期自然進(jìn)化、天然雜交、實(shí)生選種以及雜交育種等原因,現(xiàn)存的梅種質(zhì)資源和人工栽培品種的遺傳背景較為復(fù)雜。例如：花梅實(shí)生選種來(lái)自天然雜交的果核,雜交育種需要果梅親本；很多花梅品種具備不同能力的結(jié)果習(xí)性；有些果梅品種具有很高的觀賞性,這些現(xiàn)象的存在使得有關(guān)花梅與果梅遺傳關(guān)系的研究成為梅研究的重要內(nèi)容。關(guān)于梅品種資源的遺傳基礎(chǔ)研究已有不少[8-12],但尚未見(jiàn)利用不同 DNA分子標(biāo)記技術(shù)同時(shí)對(duì)花梅和果梅不同品種資源的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析的研究報(bào)道。

20世紀(jì) 90年代后期發(fā)展起來(lái)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(random am p lified po lymorphic DNA,RAPD)技術(shù)是由 W illiam s等[13]和 W elsh等[14]建立的基于PCR技術(shù)的一種分子標(biāo)記技術(shù)。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)的多態(tài)性位點(diǎn)是無(wú)限的,且不需要預(yù)知基因組序列,所用引物為隨機(jī)引物,擴(kuò)增條帶的多態(tài)性受引物結(jié)合位點(diǎn)堿基變化以及引物擴(kuò)增序列的長(zhǎng)短或有無(wú)等因素影響。RAPD技術(shù)被廣泛應(yīng)用于許多植物種類的品種分類研究、種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)研究、基因連鎖標(biāo)記、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面[15-18],對(duì)于研究植物種內(nèi)親緣關(guān)系具有重要意義。

作者采用改良的 RAPD標(biāo)記技術(shù)對(duì) 25個(gè)花梅品種和 21個(gè)果梅品種的遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究,以期為梅的科學(xué)分類以及品種資源的遺傳基礎(chǔ)研究提供更豐富的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的 25個(gè)花梅品種分屬于 9個(gè)品種群,各品種的葉片均采自江蘇省南京市中山陵園的梅園； 21個(gè)果梅品種的葉片均采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梅資源圃。隨機(jī)采集各品種健康完整的嫩葉,采集后置于液氮中速凍,放置在 -40℃冰箱中保存、備用。供試花梅及果梅的品種名、類型及原產(chǎn)地見(jiàn)表 1。

1.2 方法

1.2.1 基因組總 DNA的提取方法 利用 DNeasy PlantM ini Kit試劑盒 (Q iagen Sciences公司生產(chǎn))分別提取各品種的基因組總DNA,采用核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó) Eppendorf公司生產(chǎn))測(cè)定 DNA濃度,用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1.3％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.2 擴(kuò)增引物的篩選及 PCR方法 實(shí)驗(yàn)用 RAPD隨機(jī)引物由上海 Invitrogen生物技術(shù)公司合成,PCR擴(kuò)增參照 Shim ade等[12]的方法。在前期研究中已知增加引物長(zhǎng)度及嚴(yán)格選擇 PCR退火溫度可以克服RAPD分析過(guò)程中的不穩(wěn)定性[19],因此,經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)從 100個(gè)長(zhǎng)度為 11 bp的隨機(jī)引物中篩選出 23個(gè)引物進(jìn)行RAPD分析。篩選條件為：連續(xù)2次梯度 PCR條帶清晰且不彌散、PCR產(chǎn)物重復(fù)出現(xiàn)、有質(zhì)量好的條帶指紋；溫度以偏高為佳,對(duì)于適宜溫度范圍較大的引物則選擇中間溫度。

反應(yīng)體系總體積為 15μL,包括 0.2mmo l·L-1dNTPs、1.5mmo l·L-1M g2+、0.8mmol·L-1引物、90 ng模板 DNA、0.4 UTaqDNA聚合酶和 1×PCR buffer,用雙蒸水補(bǔ)足至 15μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

94℃預(yù)變性 5m in；94℃變性 30 s,35℃～45℃退火70 s,72℃延伸 2m in,共 42個(gè)循環(huán)；最后在 72℃條件下延伸 10 m in。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃條件下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1.3％瓊脂糖凝膠電泳 30～50m in,紫外燈下觀察并拍照。

表 1 供試花梅及果梅的品種名、類型及原產(chǎn)地1)Tab le 1 Nam e,type and or ig in of tested cu ltivars of flower ing and fru itingm ei(Prunusm um e Sieb.et Zucc.)1)

1.2.3 基因組總DNA的 RAPD-PCR分析方法 46個(gè)梅品種基因組總DNA的RAPD-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 30μL,其組成成分及擴(kuò)增反應(yīng)程序與引物篩選實(shí)驗(yàn)相同,但不同引物退火溫度略有差異,以各引物的最佳退火溫度為準(zhǔn)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物置于 4℃條件下保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 1.3％瓊脂糖凝膠電泳30～50m in,紫外燈下觀察、拍照,并統(tǒng)計(jì) 23個(gè)引物擴(kuò)增出的電泳條帶數(shù)與多態(tài)性條帶數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在電泳圖譜上,同一位點(diǎn)上有條帶記為“1”,無(wú)條帶記為“0”,將獲得的 0、1矩陣圖輸入 Excel表格中,采用 NYSYS-pc分析軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù),并用UPGMA聚類法構(gòu)建遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果和分析

2.1 RAPD-PCR的擴(kuò)增結(jié)果分析

利用篩選出的 23個(gè)隨機(jī)引物對(duì) 46個(gè)梅品種的基因組總DNA進(jìn)行RAPD-PCR標(biāo)記分析,擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2；圖 1所示則為引物 Y30的 RAPD-PCR擴(kuò)增圖譜。擴(kuò)增結(jié)果顯示：不同引物擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度范圍不同,23個(gè)隨機(jī)引物總體擴(kuò)增條帶的長(zhǎng)度范圍為 250～3 000 bp。23個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出 131條清晰的DNA條帶,平均每個(gè)引物擴(kuò)增出條帶 5.7條。不同引物擴(kuò)增得到的條帶數(shù)不同,擴(kuò)增條帶最少的為引物Y53和 Y57,均只擴(kuò)增出 2條帶；擴(kuò)增條帶最多的為引物 Y10和 Y59,均擴(kuò)增出 9條帶。引物 Y11、Y23、Y28、Y30、Y33、Y57和A 4擴(kuò)增出的條帶全部為多態(tài)性條帶,即擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率為 100.0％；引物 Y48和 Y53擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率最低,僅為 50.0％；23個(gè)引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率平均值為 81.7％。由此可見(jiàn),供試的 46個(gè)花梅和果梅品種具有較豐富的遺傳多樣性。

表2 用于46個(gè)花梅和果梅品種基因組總DNA RAPD-PCR分析的隨機(jī)引物堿基序列及 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果Tab le 2 Base sequences of random p r im ers used for RAPD-PCR ana lysis of tota l genom ic DNA from for ty-six cu ltivars of flower ing and fru iting m ei(Prunusm um e Sieb.et Zucc.)and RAPD-PCR am p lified resu lts

圖1 引物Y 30對(duì)46個(gè)花梅和果梅品種基因組總DNA的 RAPD-PCR擴(kuò)增圖譜F ig.1 RAPD-PCR am p lified pa ttern of to ta l genom ic DNA from for ty-six cu ltivars of flower ing and fru itingm ei (Prunusm um e Sieb.et Zucc.)by pr im er Y 30

2.2 基于 RAPD擴(kuò)增結(jié)果的花梅和果梅品種間的聚類分析

根據(jù) 23個(gè) RAPD隨機(jī)引物對(duì) 46個(gè)花梅和果梅品種基因組總DNA的 PCR擴(kuò)增結(jié)果、利用NYSYS-pc分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,獲得了 46個(gè)花梅和果梅品種間遺傳關(guān)系聚類圖 (圖 2)。由圖 2可見(jiàn),所有 46個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)為 0.63～0.83,在遺傳相似系數(shù) 0.66處可將 46個(gè)品種分成A、B、C、D和 E組。A組包含 6個(gè)果梅品種和 11個(gè)花梅品種,其中果梅品種‘白加賀’、‘月世界’與花梅品種‘寒紅’、‘紅雀’、‘烈公梅’、‘雪梅’和‘粉瓣果梅’聚在一起,其中‘寒紅’、‘紅雀’、‘烈公梅’、‘雪梅’和‘粉瓣果梅’等品種均屬于花梅中的江梅品種群,鑒于其既有觀花價(jià)值又有食用價(jià)值的花果兼用的特點(diǎn),因此很多結(jié)果習(xí)性較好的江梅類品種也可以視為觀賞性高的果梅；另外,果梅品種‘綦江杏梅’、‘衛(wèi)山種’、‘太湖3號(hào)’和‘軟條紅梅’與花梅品種‘復(fù)粉垂枝’、‘皺瓣垂枝’、‘小綠萼’、‘久觀綠萼’、‘異味綠萼’和‘睿山白’聚在一起,其中,‘復(fù)粉垂枝’和‘皺瓣垂枝’屬于花梅中的垂枝品種群,‘小綠萼’、‘久觀綠萼’和‘異味綠萼’屬于花梅中的綠萼品種群,‘睿山白’屬于花梅中的玉蝶品種群,表明‘綦江杏梅’、‘衛(wèi)山種’、‘太湖 3號(hào)’和‘軟條紅梅’與這些花梅品種群品種具有較近的親緣關(guān)系。B組僅包含 4個(gè)品種,且均為花梅品種,分屬于朱砂品種群和玉蝶品種群。C組共包含16個(gè)品種,除‘小花豐后’為花梅品種外,其余品種均為果梅,且從日本引進(jìn)的果梅品種有 6個(gè),其中花梅品種‘小花豐后’與從日本引進(jìn)的果梅品種‘豐后’聚在一起,說(shuō)明‘小花豐后’和‘豐后’可能是由于地域或一致的育種來(lái)源等原因而具有較近的親緣關(guān)系。D組僅包含 4個(gè)品種且均為花梅品種,其中‘紅花晚跳’和‘鬼桂花’這 2個(gè)品種均屬于花梅中的灑金品種群,雖然二者的原產(chǎn)地分別為中國(guó)和日本,但二者具有較近的遺傳關(guān)系；該組中的‘月宮殿’屬于玉蝶品種群,‘多萼黃香’屬于黃香品種群。E組共包含 5個(gè)梅品種,且均屬于花梅中的宮粉品種群。從聚類圖中可以看到：供試的 21個(gè)果梅品種和 25個(gè)花梅品種并不是簡(jiǎn)單地被分成 2類,而是根據(jù)遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近被聚在不同的分組中,說(shuō)明花梅和果梅品種具有一定的遺傳相似性。此外,各分組中二類梅品種的數(shù)量差異較大,可能與不同品種的地理來(lái)源或遺傳背景以及不同品種群的取樣量等因素有關(guān)。

3 討論和結(jié)論

從46個(gè)花梅和果梅品種的 RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果來(lái)看,用篩選出的 23個(gè)隨機(jī)引物共擴(kuò)增出 131條帶,其中多態(tài)性條帶 107條,即 46個(gè)花梅和果梅品種基因組總DNA包含 107個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),多態(tài)性條帶百分率達(dá)到 81.7％,表明RAPD分子標(biāo)記技術(shù)在梅的品種鑒定以及遺傳多樣性分析中具有一定的高效性。從遺傳聚類分析結(jié)果看,46個(gè)品種并沒(méi)有單純地聚為花梅和果梅 2大類,而基本上是根據(jù)遺傳相似系數(shù)互相交叉混合聚成 5類,部分花梅品種單獨(dú)成組可能與品種之間具有相似的育種系譜有關(guān)。

花梅和果梅在園藝學(xué)性狀上具有一定的差別,在應(yīng)用過(guò)程中人們主要利用花的顏色、花瓣數(shù)和果實(shí)顏色來(lái)區(qū)分梅的類型與品種。但是,基于 RAPD標(biāo)記技術(shù)的聚類分析結(jié)果顯示：花梅和果梅在遺傳學(xué)上是親緣關(guān)系極近的同一類群植物,這與 L i等[6]和 Hayashi等[7]分別利用 SNP和 SSR分子標(biāo)記得出的研究結(jié)果一致。大量花梅與果梅品種的出現(xiàn)與人為選擇和利用以及有計(jì)劃的育種密切聯(lián)系。將果實(shí)與果核應(yīng)用于花梅的實(shí)生選種以及雜交育種工作中,使得大量花梅品種具備一定的結(jié)實(shí)能力；花果兼用型梅品種的存在也在一定程度上證明了花梅與果梅同屬于一個(gè)類群,具有相近的遺傳背景。

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