裴 慧,錢(qián)士輝

中藥急性子為鳳仙花科 (Balsam inaceae)植物鳳仙花 (ImpatiensbalsaminaL.)的干燥成熟種子[1],中國(guó)大部分地區(qū)均有分布,資源豐富。急性子具有破血軟堅(jiān)、消積的功效,其味微苦、性溫,有小毒；入肝、脾經(jīng)、降氣行瘀,主治經(jīng)閉、噎膈、腹部腫塊、骨哽咽喉和外瘍堅(jiān)塊[1]；臨床上可用于避孕[2],終止早孕[3],食管賁門(mén)癌及梗阻、癌癥、腫瘤[4],閉經(jīng)和骨質(zhì)增生等[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：急性子具有促透皮、抗生育、抗腫瘤及抗菌等作用。

細(xì)胞異常增殖是惡性腫瘤的生物學(xué)特征之一,檢測(cè)藥物是否影響腫瘤細(xì)胞的增殖活性通常是篩選抗腫瘤藥物的主要方法。M TT法(噻唑藍(lán)法)是最為常用的方法之一,該法靈敏度高,線性關(guān)系好,簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速,廣泛應(yīng)用于大規(guī)?？鼓[瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等方面[6]。

作者以人肺癌A 549細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)從急性子中分離得到的雙萘呋喃 -7,12-酮類化合物balsam inone A和 balsam inone B體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用以及對(duì)細(xì)胞周期的影響進(jìn)行研究,以期為抗腫瘤中藥的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺癌A 549細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

急性子購(gòu)自江蘇省盱眙縣中藥飲片廠,經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢(qián)士輝研究員鑒定為鳳仙花的干燥成熟種子。采用體積分?jǐn)?shù) 80％和 60％乙醇加熱回流提取,并經(jīng)溶劑萃取、D 101大孔樹(shù)脂富集、硅膠柱層析、Sephadex LH-20和ODS柱層析以及重結(jié)晶等方法獲得提取物,再經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、M S、IR和UV等方法鑒定結(jié)構(gòu),并參照文獻(xiàn)[7]的數(shù)據(jù)鑒定提取物為balsam inone A和 balsam inone B,經(jīng) HPLC檢測(cè)純度均大于98％。臨用時(shí)用DM EM培養(yǎng)液分別配制成不同濃度備用,其中DM SO終濃度小于體積分?jǐn)?shù)0.5％。

主要試劑包括：DM EM完全培養(yǎng)基(美國(guó) GIBCO公司,批號(hào)：450542)、新生牛血清 (蘭州民海生物工程有限公司,批號(hào)：080508)、M TT(美國(guó)AMRESCO公司,批號(hào)：0793)、胰酶 (美國(guó) AMRESCO公司,批號(hào)： 0458)、碘化吡啶(PI染液,美國(guó) Sigm a公司)、核糖核酸酶 (美國(guó) Sigm a公司 )、TritonX-100(美國(guó)AMRESCO公司,批號(hào)：010T0405)、DM SO(美國(guó)AMRESCO公司,批號(hào)：019D 0404)和 5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司,批號(hào)：0710052)。

主要儀器包括：HERA Cell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo Fisher Scientific Inc.)、CKX31 SF倒置相差顯微鏡(日本OLYM PUS公司)、Thermo Scientific M u ltiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (美國(guó) Thermo Fisher Scientific Inc.)、MH-1403平板振蕩器 (江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司)和 FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將A 549細(xì)胞接種在含體積分?jǐn)?shù)10％滅活小牛血清的 DM EM完全培養(yǎng)基上,置于溫度 37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),當(dāng)細(xì)胞單層面積長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶瓶底面積70％～80％時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定 采用M TT法[8]測(cè)定A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A 549細(xì)胞,用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù) 0.25％胰酶和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.02％EDTA混合消化液消化,用含體積分?jǐn)?shù) 10％滅活小牛血清的DM EM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至5×104mL-1,接種到 96孔培養(yǎng)板中,每孔 100μL細(xì)胞懸液；繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后,吸棄培養(yǎng)液；處理組分別添加含不同濃度 balsam inoneA和 balsam inoneB的培養(yǎng)液 90μL至終濃度為 20、40、60和 80μmol·L-1,陰性對(duì)照添加含 PBS的 DM EM完全培養(yǎng)基 90μL,陽(yáng)性對(duì)照添加含 5-氟尿嘧啶的DM EM完全培養(yǎng)基90μL至最終質(zhì)量濃度 100m g·L-1；每處理及陰性、陽(yáng)性對(duì)照均設(shè) 6個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白調(diào)零孔；繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入 5 g·L-1M TT 10μL；繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸棄上清液,每孔加入100μL DM SO,振蕩 10m in,溶解結(jié)晶；用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光值(A),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率,公式為：生長(zhǎng)抑制率 =〔(A陰性對(duì)照-A用藥)/A陰性對(duì)照〕×100％。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A 549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度至 1×105mL-1,接種于 6孔板中,每孔 2mL細(xì)胞懸液；培養(yǎng) 24 h后,處理組分別添加含不同濃度 balsam inone A和B的培養(yǎng)液2mL至終濃度為 20、40、60和 80μmol·L-1,對(duì)照組添加含體積分?jǐn)?shù)10％滅活小牛血清的DM EM完全培養(yǎng)基 2mL,重復(fù) 3次；培養(yǎng) 48 h后分別收集細(xì)胞,并于 1 500 r·m in-1離心 5m in,PBS洗滌后,經(jīng) 300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾,調(diào)整細(xì)胞密度至 1×106mL-1；加入由50mL·L-1PI和 25m g·L-1RNase A組成的染液 1 mL,4℃避光染色 30m in后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè),參照文獻(xiàn)[9]的方法分析A 549細(xì)胞的周期。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用 SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用M odfit軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析,并據(jù)此計(jì)算出DNA合成前期、DNA合成期和DNA合成后期細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果和分析

2.1 對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

采用M TT法檢測(cè)不同濃度 balsam inone A和 B對(duì)人肺癌 A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用,結(jié)果見(jiàn)表 1。與陰性對(duì)照組相比,20、40、60和 80μmo l·L-1balsam inone A和 B對(duì) A 549細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著抑制作用 (P＜0.05),各處理組的吸光值均顯著低于陰性對(duì)照組；且隨著二者濃度的提高,對(duì) A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均呈逐漸增加的趨勢(shì),這一作用具有明顯的量效關(guān)系。但各處理組的吸光值均大于陽(yáng)性對(duì)照組(100m g·L-15-氟尿嘧啶),其中,balsam inone B各處理組的吸光值與陽(yáng)性對(duì)照組有較大差異,而 20和40μmol·L-1balsam inone A處理組的吸光值與陽(yáng)性對(duì)照組也有較大差異,但 60和 80μmo l·L-1balsam inone A處理組的吸光值與陽(yáng)性對(duì)照組的差異較小。由生長(zhǎng)抑制率可見(jiàn)：各處理組對(duì)A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均低于陽(yáng)性對(duì)照組,其中 20、40、60、80 μmo l·L-1balsam inone B處理組和 20、40μmo l·L-1balsam inone A處理組的生長(zhǎng)抑制率與陽(yáng)性對(duì)照組差異較大,而 60和 80μmol·L-1balsam inone A對(duì)A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率接近陽(yáng)性對(duì)照組。

表 1 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(±SD)1)Tab le 1 The grow th inh ib ition effect of d ifferen t concen tra tion s of ba lsam inone A and ba lsam inone B on hum an lung cancer A 549 cell (±SD)1)

表 1 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對(duì)人肺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用(±SD)1)Tab le 1 The grow th inh ib ition effect of d ifferen t concen tra tion s of ba lsam inone A and ba lsam inone B on hum an lung cancer A 549 cell (±SD)1)

1)CK1：陰性對(duì)照 Negative contro l；CK2：陽(yáng)性對(duì)照 (100m g·L-1 5 -氟尿嘧啶)Positive con tro l(100m g·L-1 5-FU).＊：與陰性對(duì)照相比差異顯著 (P＜0.05)Significant difference compared w ith the negative control(P＜0.05).

處理Treatment濃度/μmo l·L-1 Concentration A570生長(zhǎng)抑制率/％ Grow th inhibition rate CK1 - 1.379±0.701 -CK2 - 0.305±0.026＊ 77.882 Balsam inone A 20 0.692±0.043＊ 49.819 40 0.423±0.036＊ 69.326 60 0.351±0.008＊ 74.547 80 0.328±0.041＊ 76.215 Balsam inone B 20 0.617±0.053＊ 55.257 40 0.605±0.031＊ 56.128 60 0.551±0.007＊ 60.044 80 0.532±0.020＊ 61.421

2.2 對(duì)A549細(xì)胞周期分布的影響

人肺癌A 549細(xì)胞的細(xì)胞周期特點(diǎn)是細(xì)胞群分布于細(xì)胞的各個(gè)時(shí)期。經(jīng)不同濃度 balsam inone A和B處理后A 549細(xì)胞各時(shí)期的比例見(jiàn)表 2。

表 2 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對(duì)人肺癌 A 549細(xì)胞周期分布的影響(±SD)1)Tab le 2 Effectsof d ifferen t concen tra tions of ba lsam inone A and ba lsam inone B on d istr ibu tion of cycle of hum an lung cancer A 549 cell(± SD)1)

表 2 不同濃度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B對(duì)人肺癌 A 549細(xì)胞周期分布的影響(±SD)1)Tab le 2 Effectsof d ifferen t concen tra tions of ba lsam inone A and ba lsam inone B on d istr ibu tion of cycle of hum an lung cancer A 549 cell(± SD)1)

1)G0/G1：DNA合成前期 DNA p resynthesisphase；S：DNA合成期DNA synthesisphase；G2/M：DNA合成后期DNA postsynthesisphase.＊：與各自的對(duì)照相比差異顯著(P＜0.05)Significantdifference compared w ith the respective control(P＜0.05).

處理Treatm en t濃度/μmol·L-1 Concentration比例/％ Proportion G0/G1 S G2/M對(duì)照CK - 82.393±1.764 13.108±1.255 4.498±0.592 Balsam inone A 20 75.785±3.696＊ 17.483±2.411 6.733±1.366 40 74.427±6.014＊ 17.750±4.627＊ 7.820±2.415＊60 74.485±4.466＊ 18.553±2.809＊ 6.960±2.312 80 74.380±6.226＊ 16.713±3.740 8.905±2.573＊對(duì)照CK - 82.091±2.015 14.152±2.698 3.753±2.797 Balsam inone B 20 78.643±2.393 17.903±0.080＊ 3.913±2.800 40 77.493±2.955 19.090±0.635＊ 3.417±2.503 60 75.467±3.147＊ 20.713±1.832＊ 3.863±1.386 80 74.740±2.681＊ 21.417±1.381＊ 3.843±1.519

20、40、60和 80μmol·L-1balsam inone A作用于A 549細(xì)胞 48 h后,各處理組 DNA合成前期 (G0/G1期)的細(xì)胞比例均較對(duì)照顯著減少 (P＜0.05)；DNA合成期 (S期)的細(xì)胞比例均較對(duì)照有所增加,其中, 40和 60μmo l·L-1balsam inone A處理組與對(duì)照差異顯著；DNA合成后期(G2/M期)的細(xì)胞比例也均較對(duì)照有所增加,其中,40和 80μmo l·L-1balsam inone A處理組與對(duì)照差異顯著。研究結(jié)果表明：balsam inone A作用于A 549細(xì)胞,但無(wú)明顯的量效關(guān)系。

20、40、60和 80μmo l·L-1balsam inone B作用于A 549細(xì)胞 48 h后,各處理組 G0/G1期的細(xì)胞比例均較對(duì)照減少,其中,60和 80μmo l·L-1balsam inone B處理組與對(duì)照差異顯著；S期的細(xì)胞比例均較對(duì)照顯著增加；各處理組 G2/M期的細(xì)胞比例與對(duì)照差異不大,但 20、60和 80μmo l·L-1balsam inone B處理組較對(duì)照小幅增加,而 40μmo l·L-1balsam inone B處理組較對(duì)照小幅減少。研究結(jié)果表明：balsam inone B作用于A 549細(xì)胞的 G0/G1期和 S期,且有明顯的量效關(guān)系。

3 討 論

惡性腫瘤細(xì)胞異常增殖是其生物學(xué)特征之一,而腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡相互拮抗的最終結(jié)果,由于細(xì)胞凋亡的存在,拮抗了細(xì)胞的加速增殖,維持細(xì)胞自身穩(wěn)定,在臨床上常通過(guò)各種方法和手段誘發(fā)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而達(dá)到治療腫瘤目的。

本文的研究結(jié)果表明：從急性子中分離得到的balsam inone A和 balsam inone B對(duì)人肺癌 A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有較為顯著的抑制作用,其生長(zhǎng)抑制率隨2個(gè)化合物濃度的提高而增強(qiáng),具有明顯的量效關(guān)系。但這 2個(gè)化合物對(duì)A 549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用低于常用的藥物 5-氟尿嘧啶,推測(cè)其原因與化合物濃度、抑制作用的機(jī)制等多種因素有關(guān),有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

供試的 2個(gè)化合物對(duì)人肺癌A 549細(xì)胞周期均有影響。balsam inone A能導(dǎo)致 A 549細(xì)胞DNA合成前期(G0/G1期)的細(xì)胞比例減少、DNA合成期(S期)和DNA合成后期 (G2/M期)的細(xì)胞比例增加,說(shuō)明balsam inone A主要是將人肺癌A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)周期阻滯在 S期和 G2/M期,從而抑制 A 549細(xì)胞生長(zhǎng)。balsam inone B則能導(dǎo)致A 549細(xì)胞中 G0/G1期的細(xì)胞比例減少、S期的細(xì)胞比例增加,且這一作用具有明顯的量效關(guān)系,而對(duì) G2/M期細(xì)胞則無(wú)明顯作用,說(shuō)明balsam inone B主要是將A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)周期阻滯在S期,阻止細(xì)胞進(jìn)入 G2/M期,從而抑制 A 549細(xì)胞的生長(zhǎng)。推測(cè)這 2個(gè)化合物對(duì)人肺癌A 549細(xì)胞不同的作用機(jī)制可能與 balsam inone A結(jié)構(gòu)中包含羥基而balsam inone B結(jié)構(gòu)中包含葡萄糖苷基有關(guān)。balsam inoneA和B對(duì)A 549細(xì)胞周期的影響機(jī)制可能是影響細(xì)胞周期蛋白的合成,也可能是通過(guò)其他途徑影響基因表達(dá),其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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