孫雪峰,朱易凡,楊軼軒,何 松△

(1.重慶三峽中心醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶萬州 404000；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科，廣州510080；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科 400010)

胃癌細(xì)胞的多藥耐藥(MDR)是胃癌患者化療失敗的主要原因[1-5]。長(zhǎng)春新堿耐藥型細(xì)胞系SGC7901/VCR源自于人類胃癌細(xì)胞系SGC7901，通過在體外使用長(zhǎng)春新堿逐步篩選而獲得，對(duì)順鉑、依托泊苷、絲裂霉素C及5-氟尿嘧啶(5-FU)等其他抗腫瘤藥物呈交叉耐藥,是一個(gè)廣泛使用的MDR細(xì)胞模型。本研究通過對(duì)SGC7901/VCR的研究，進(jìn)一步了解胃癌MDR的分子生物學(xué)機(jī)制，期待能為胃癌患者提供更有效的治療手段。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 長(zhǎng)春新堿MDR人類胃癌細(xì)胞系SGC7901/VCR及其母細(xì)胞系SGC7901，由第四軍醫(yī)大學(xué)的樊代明院士贈(zèng)送。

1.2主要試劑及儀器 IPG干膠條、考馬斯亮藍(lán)G-250、三Tris Base、SDS、PVDF膜、ECL購自Amersham Biosciences。HSP27、HSP90、ACTIN的單克隆或多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，雙向電泳系統(tǒng)、圖像掃描器、電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(ESI-Q-TOF-MS)購自Micromass公司。

1.3雙向凝膠電泳 用裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，100 mmol/L DTT，4% CHAPS，40 mmol/L Tris，2%載體兩性電解質(zhì)，1 mg/mL脫氧核糖核酸酶Ⅰ，1 mmol/L Na3VO4和1 mmol/L PMSF)，使細(xì)胞裂解。將細(xì)胞裂解液4 ℃、15 000 r/min離心30 min,收集上清液，測(cè)定總蛋白濃度。水化液(含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，0.2% DTT，0.5%(v/v) pH 3～10的IPG緩沖液，微量溴酚蘭)將500 μg蛋白樣品稀釋至450 μ L，加樣至IPG膠條上，然后30 V水化24 h。IEF參數(shù)為：500 V聚焦1 h，1 000 V聚焦1 h，8 000 V聚焦8.5 h，總計(jì)68 kVh。聚焦后IPG膠條使用平衡溶液(含6 mol/L尿素，2% SDS，30% 甘油，pH 8.8的50 mmol/L Tri-HCL，1%的DTT)平衡15 min，之后用同樣的溶液(只是用2.5%碘乙酰胺代替上述溶液中的DTT)再平衡15 min。之后IPGphor，Ettan DALT II系統(tǒng)進(jìn)行第二向SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后G-250對(duì)雙向電泳的凝膠進(jìn)行染色，PDQuest系統(tǒng)加以分析[6]。

1.4ESI-Q-TOF-MS分析[7]剪下不同的蛋白質(zhì)點(diǎn)跡和蛋白質(zhì)條帶，使用含乙腈的新配制溶液使之脫色，之后真空離心干燥。干燥后的凝膠塊用10 μL胰酶溶液(含40 mmol/L NH4HCO3的9%ACN溶液和20 μg/mL蛋白質(zhì)組級(jí)別的胰酶)在37 ℃下孵育10～12 h。使用Millipore Zip Tip C18純化多肽混合物。將經(jīng)過純化的多肽混合物加樣LC/MS,DDA模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜檢測(cè)的參數(shù)：毛細(xì)管電壓為3 000 V，進(jìn)樣錐電壓為45 V，源溫度為80 ℃，碰撞氣體背壓為15 psi。

表1 ESI-Q-TOF-MS鑒定出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)有100 mmol/L NH4HCO3的50%

a:Swiss-Prot號(hào)；b:↑表示與SGC7901相比，SGC7901/VCR有大于或等于2倍的增加?！硎九cSGC7901相比，SGC7901/VCR有大于或等于2倍的下降。

1.5數(shù)據(jù)庫分析 將MS/MS產(chǎn)生的PKL格式的文件錄入Mascot搜索引擎中。搜索參數(shù)按如下設(shè)置：質(zhì)量容許誤差為±1.0道爾頓；MS/MS容許誤差為±0.5道爾頓；可允許有一個(gè)沒有計(jì)數(shù)的剪切位點(diǎn)；固定修飾為半胱氨酸；可變修飾選擇為氧化；數(shù)據(jù)格式選擇為Micromass PKL格式；工具選擇為ESI-Q-TOF。

1.6Western blot檢測(cè) 使用裂解液(含50 mmol/L Tris，pH 7.4，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，2.5 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100，0.5% NP-40)在4 ℃下將細(xì)胞裂解30 min,收取上清液,測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉的TBS緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 7.6，100 mmol/L NaCl2，0.5%的Tween-20)阻斷過夜。然后在室溫下一抗溶液(5%脫脂奶粉的TBS緩沖液以1∶1 500～1∶2 000比例稀釋)孵育3 h。二抗溶液(1∶3 000稀釋)在室溫下孵育1 h。TBS-T 3次洗脫后，ECL系統(tǒng)檢測(cè)。所有的Western blot檢測(cè)均重復(fù)3次。

1.7將HSP27的反義寡核苷酸鏈(ASO)導(dǎo)入細(xì)胞 所使用的HSP27的ASO對(duì)應(yīng)HSP27的反義起始位置(5′-GGG ACG CGG CGC TCG GTC AT-3′)[8]，錯(cuò)義ASO為對(duì)照(5′-CAG CGC TGA CAA CAG TTT CAT-3′)。轉(zhuǎn)染前1 d，將SGC7901/VCR細(xì)胞接種在6孔板和96孔板中，細(xì)胞密度為105個(gè)/mL。當(dāng)細(xì)胞呈30%～50%融合時(shí)，50 nmol/L HSP27 ASO 或錯(cuò)義ASO轉(zhuǎn)染細(xì)胞。HSP27 ASO或錯(cuò)義ASO轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞共2 d，轉(zhuǎn)染結(jié)束時(shí)，用不同濃度的長(zhǎng)春新堿或阿霉素孵育細(xì)胞24 h。Western blot分析測(cè)定HSP27的表達(dá)水平，MTT檢查SGC7901/VCR的細(xì)胞活性。

1.8免疫共沉淀(IP) 4 ℃下將細(xì)胞在免疫共沉淀緩沖液中(含20 mmol/L Tris，pH 7.4，100 mmol/L的NaCl，1% NP-40，0.5 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L Na3VO4，0.5 mmol/L PMSF)孵育30 min使細(xì)胞裂解。收集上清液，進(jìn)行免疫共沉淀。首先使用非免疫血清對(duì)1 500 μg總蛋白進(jìn)行預(yù)清除。接著，將20 μg HSP27抗體與預(yù)清除的上清液在4 ℃下共孵育3 h。然后加入100 μL protein-G 瓊脂糖珠子，繼續(xù)孵育1 h。離心30 s后，TBS-T緩沖液洗3次,用0.1 M的氨基乙酸(pH=3)洗脫免疫復(fù)合物。SDS-PAGE電泳后考馬斯亮蘭R-250染色,條帶胰酶消化，進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定 通過雙向電泳，將SGC7901/VCR細(xì)胞株及其對(duì)應(yīng)細(xì)胞株SGC7901的總蛋白進(jìn)行差異展示(圖1)。與SGC7901相比，SGC7901/VCR中20 kDa大小連續(xù)3個(gè)點(diǎn)的表達(dá)顯著性上調(diào)(表1)。ESI-Q-TOF-MS分析，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索。3個(gè)點(diǎn)均鑒定為熱休克蛋白27(HSP27)。圖2顯示了代表性的MS/MS結(jié)果。從y-片段電子系列中的質(zhì)量差異中，鑒定出m/z值為974.327 0多肽片段的氨基酸序列為GPSWDPFRDWYPHSR，該序列是HSP27序列的一部分。

圖1 SGC7901長(zhǎng)春新堿耐藥的SGC7901/VCR細(xì)胞系的雙向電泳圖

2.2HSP27與MDR的關(guān)系 Western blot分析顯示HSP27 ASO轉(zhuǎn)染后HSP27的表達(dá)顯著下降，錯(cuò)義ASO轉(zhuǎn)染后，其HSP27表達(dá)沒有變化(圖3A)。在HSP27 ASO轉(zhuǎn)染后，與不同濃度的長(zhǎng)春新堿和阿霉素共同孵育24 h，SGC7901/VCR對(duì)長(zhǎng)春新堿和阿霉素的化療敏感性增強(qiáng)，細(xì)胞活性顯著降低(圖3B)。

圖2 蛋白的ESI-Q-TOF-MS分析結(jié)果

A： HSP27 ASO轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞顯著抑制了HSP27蛋白表達(dá)水平；B： HSP27 ASO轉(zhuǎn)染SGC7901/VCR細(xì)胞增強(qiáng)了長(zhǎng)春新堿和阿霉素的化療敏感性。試驗(yàn)重復(fù)3次。*：P≤0.05。Oligofectamine組僅用轉(zhuǎn)染因子oligofectamine轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

2.3HSP27相互作用蛋白的鑒定 通過免疫沉淀和質(zhì)譜分析，在HSP復(fù)合物中共鑒定出25種蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)的功能，鑒定出的蛋白質(zhì)可分為8個(gè)功能種類：細(xì)胞骨架、分子伴侶、代謝酶、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、核糖體蛋白、DNA修復(fù)蛋白、轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白以及RNA加工蛋白，這些功能與HSP27復(fù)合物的功能有很好的相關(guān)性。

2.4HSP27相互作用蛋白的確認(rèn) 通過IP和Western blot分析證實(shí)β-catenin、HSP90和Actin與HSP27相互作用(圖4),在IgY陰性對(duì)照中則未檢測(cè)到。

圖4 Western blot驗(yàn)證HSP27的相互作用蛋白

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)春新堿MDR的胃癌細(xì)胞系SGC7901/VCR及其母細(xì)胞系SGC7901之間，HSP27有顯著性的差異表達(dá)。當(dāng)SGC7901/VCR中的HSP27的過表達(dá)受到HSP27 ASO的抑制時(shí)，細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿和阿霉素的敏感性增加。這明確顯示HSP27在SGC7901/VCR的過表達(dá)和SGC7901/VCR多藥耐受表型相關(guān)。

作者進(jìn)一步鑒定了25種與HSP27相互作用的蛋白，并免疫共沉淀確認(rèn)了β-catenin、Actin及HSP90與HSP27的相互作用。這提示HSP27與細(xì)胞骨架蛋白(如肌動(dòng)蛋白，肌動(dòng)蛋白-類蛋白)形成一種復(fù)合物，參與肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)，防止細(xì)胞骨架因?yàn)槎喾N應(yīng)激因素而解離[9]。細(xì)胞骨架的解離是化療藥物造成細(xì)胞損傷早期的和核心的事件?；熕幬镌斐杉?xì)胞損傷后，在細(xì)胞骨架重組期間，HSP27能與細(xì)胞骨架相互作用，而HSP27高表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞細(xì)胞骨架的重組,從而逃避化療藥物殺傷。

本研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白(包括核糖體蛋白P0和核磷蛋白)與HSP27相互作用。核磷蛋白是一種多功能蛋白，在細(xì)胞周期中，可穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間。有學(xué)者猜測(cè)其穿梭能力與其分子伴侶活性有關(guān)[10-12]，從而在細(xì)胞分化、凋亡的過程中，發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。核磷蛋白參與腫瘤的多藥耐受表型，很可能是通過抑制細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)[13]。本研究表明了HSP27與核磷蛋白形成復(fù)合物，并導(dǎo)致耐藥的直接證據(jù)。

另外，與HSP27相互作用的一些蛋白，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。在這些蛋白中，β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵組成成分[14-15]。β-catenin能與α-catenin及E-cadherin相互作用，激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致干細(xì)胞存活及腫瘤產(chǎn)生。

本研究證實(shí)在胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR中,細(xì)胞MDR與HSP27的高表達(dá)相關(guān)，并且提供了HSP27與MDR機(jī)制緊密相關(guān)的證據(jù)。但是，HSP27在腫瘤長(zhǎng)春新堿耐藥中的作用機(jī)制仍有難以理解之處?？赡芘cHSP27還參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化等更為復(fù)雜的過程有關(guān)。

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