楊憲勇

(泰山醫(yī)學院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜Glehnia littora-lis Fr. Schmidt ex Miq.的干燥根及根莖[1]。北沙參具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、強心、抗突變、調(diào)解免疫系統(tǒng)等多種藥理作用[2]。常應用在抗衰老和癌癥化療后恢復體質(zhì)的中藥方劑中,為臨床常用中藥[3]。本實驗探討北沙參超臨界二氧化碳(SFE-CO2)萃取物對免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴細胞亞群影響，為其進一步應用與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1藥物 注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，批號：11102305，上海華聯(lián)制藥有限公司產(chǎn)品；注射用生理鹽水(NS)，批號：1D11061709；北沙參SFE-CO2萃取物由泰山醫(yī)學院動脈粥樣硬化研究所惠贈；二甲亞砜(DMSO)。

1.1.2動物 清潔級C57BL/6J小鼠，6～7周齡，18～22 g，泰山醫(yī)學院免疫學教研室惠贈，動物飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，相對濕度(50±5)%，自由進食和飲水。

1.1.3試劑 CD3-FITC，CD4-PE，CD8-PE熒光單抗，批號：11101207，USA Biolegen 公司；溶血素，批號：11091902，USA BD公司。

1.1.4儀器 FACScaliur流式細胞儀 ，USA BD公司；B160A型水平離心機，河北白洋離心機廠；全自動生化儀，日本日立公司；三分類血球計數(shù)儀，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組 采用正常C57BL/6J雌性小鼠，隨機分為4組，每組8只： 第1組為正常對照組，第2組為免疫抑制組，第3組為北沙參SFE-CO2萃取物高劑量組，第4組為北沙參SFE-CO2萃取物低劑量組。第1組連續(xù)6天靜滴DMSO 0.1 ml，前3天連續(xù)靜滴0.1 ml NS；第2組連續(xù)6天靜滴DMSO 0.1 ml，前3天靜滴80 mg/(kg·d) CTX；第3組連續(xù)6天靜滴4 g/kg(北沙參生藥)的北沙參SFE-CO2萃取物的DMSO溶液，前3天靜滴80 mg/(kg·d) CTX；第4組連續(xù)6天靜滴劑量為2 g/kg(北沙參生藥)的北沙參SFE-CO2萃取物的DMSO溶液，前3天靜滴80 mg/(kg·d) CTX[4]。

1.2.2外周血白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血小板(PLT)的測定 第7天處死小鼠，眼靜脈取血，EDTA抗凝，血球計數(shù)儀自動檢測WBC、RBC、PLT。

1.2.3流式細胞術(shù)分析 取EDTA抗凝全血100 μl，分別加入3只上樣管，管1加入鼠抗鼠IgG1-FITC、IgG1-PE各20 μl；管2加入CD3-FITC、CD4-PE各20 μl；管3加入CD3-FITC、CD8-PE各20 μl；室溫避光孵育15 min。加入裂解液1 ml，室溫避光8 min，500 r/min離心5 min，0.9%NS洗2次，500 μl NS重懸，上機，用流式細胞儀檢測其陽性表達率。根據(jù)T細胞亞群比例和細胞絕對計數(shù)，計算T細胞亞群絕對數(shù)量[5]。

2 結(jié) 果

2.1北沙參SFE-CO2萃取物對CTX誘導免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血WBC、RBC、PLT的影響

北沙參SFE-CO2萃取物能顯著提高CTX誘導免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血WBC和PLT的數(shù)量(P<0.05)，但未達到正常對照組的水平，北沙參SFE-CO2萃取物不同濃度間無顯著差異。見表1。

表1 北沙參SFE-CO2萃取物對免疫抑制C57BL/6J小鼠WBC、RBC和PLT的影響

2.2北沙參SFE-CO2萃取物對CTX誘導免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

北沙參SFE-CO2萃取物能提高免疫抑制C57BL/6J小鼠CD3+T 、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細胞在外周血的含量 (P<0.05) ，北沙參SFE-CO2萃取物低劑量時提高免疫抑制C57BL/6J小鼠CD3+CD4+T細胞的作用比高劑量強(P<0.05)；高劑量時提高免疫抑制C57BL/6J小鼠CD3+CD8+T細胞的作用比低劑量強(P<0.05)；但兩組數(shù)值都低于正常對照組(P<0.05)。

北沙參SFE-CO2萃取物低劑量時，CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值與正常對照組無顯著差異(P>0.05)，說明低劑量北沙參SFE-CO2萃取物已使免疫抑制的小鼠CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值恢復到正常水平；高劑量北沙參SFE-CO2萃取物不能提高CD3+CD4+T/CD3+CD8+T比值。見表2。

表2 北沙參SFE-CO2萃取物對CTX誘導免疫抑制C57BL/6J小鼠T淋巴細胞亞群的影響

3 討 論

北沙參屬常用補陰藥，多用于陰虛肺熱等癥，具有補虛扶正祛邪的功效，可增強細胞免疫、體液免疫[6]。北沙參SFE-CO2萃取物中的很多成分具有生物活性，其中2,6-十六烷基-1-(+)-抗壞血酸酯具有抗老化、抗不良刺激、活血化淤、免疫調(diào)節(jié)[7]等功效；角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強機體免疫能力、抗腫瘤等多種生理功能[8]。

骨髓是人和哺乳動物的造血器官和中樞免疫器官，骨髓抑制是化療藥物最明顯毒副作用之一[5]。外周WBC是機體抵御外界微生物的重要組成部分，其壽命短暫，需骨髓干細胞源源不斷分化補充。本實驗觀察到化療藥物CTX導致C57BL/6J小鼠的外周血WBC數(shù)量減少，北沙參SFE-CO2萃取物可以明顯增加免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血中WBC數(shù)量，表明北沙參SFE-CO2萃取物可拮抗CTX所導致的WBC的減少，具有增強免疫抑制C57BL/6J小鼠的免疫功能。

T淋巴細胞主要介導機體內(nèi)的細胞免疫功能，包括CD4+T細胞和CD8+T細胞。實驗觀察到，北沙參SFE-CO2萃取物可顯著提高免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血中CD3+T、CD4+T和CD8+T細胞的絕對數(shù)量，提示北沙參SFE-CO2萃取物對免疫抑制C57BL/6J小鼠的細胞免疫具有改善作用。

本實驗初步研究了北沙參SFE-CO2萃取物對免疫抑制C57BL/6J小鼠外周血WBC數(shù)與外周血T細胞亞群細胞數(shù)量的影響，結(jié)果提示北沙參SFE-CO2萃取物對免疫抑制C57BL/6J小鼠外周免疫系統(tǒng)有較顯著的恢復作用，其分子機制有待進一步的研究。

[1] 中國藥典.一部[S]. 北京:中國醫(yī)藥出版社,2010:92.

[2] 鄭虎占,董澤宏,余靖.中藥現(xiàn)代研究與應用[M].北京:學苑出版社,1997：46.

[3] 耿增巖,喬逸,楊曉青,等.北沙參的研究進展[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2006,26(6):62-63.

[4] 蘇穎,郭焱,劉智,等. 益氣方對化療所致小鼠免疫功能影響的實驗研究[J] 長春中醫(yī)藥大學學報,2011,27(1):3-4.

[5] Huang XL,Zhou YW,Wang W.Pharmacological research advances on total flavonoids of Epimedium[J].Chin Tradit Pat Med,2005,27(6):719-721.

[6] 李儀奎,姜名瑛.中藥藥理學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,1992:180.

[7] 崔艷梅,婁安如,趙長琦.紅景天屬植物化學成分及藥理作用研究進展[J].北京師范大學學報(自然科學版),2008,44(3):328-333.

[8] 許瑞波,劉瑋煒,王明艷,等.角鯊烯的制備及應用進展[J].山東醫(yī)藥,2005,25(35):69-70.