王亞菲 王娟 張鵬志 米文娟 蔣興旺 王潔 邱建華

研究表明，過(guò)度的噪聲刺激會(huì)損傷耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)以及螺旋韌帶，從而引起暫時(shí)性閾移或永久性閾移。縫隙連接廣泛存在于機(jī)體各組織細(xì)胞間，具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及進(jìn)行細(xì)胞間物質(zhì)交換的作用。它由相鄰兩細(xì)胞胞膜上的半通道對(duì)接而成，而半通道由六個(gè)縫隙連接蛋白組成。研究報(bào)道，縫隙連接蛋白通過(guò)其配體對(duì)縫隙連接的調(diào)節(jié)及組裝發(fā)揮作用[1]，此外還具有改變細(xì)胞增殖、分化及抗損傷的能力[2,3]。在耳蝸外側(cè)壁細(xì)胞間也存在縫隙連接，其不僅作為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及胞間物質(zhì)交換的通道，而且對(duì)維持內(nèi)淋巴電位及促進(jìn)鉀離子內(nèi)淋巴循環(huán)發(fā)揮重要作用[4,5]。本研究觀察噪聲致聾后耳蝸聽(tīng)覺(jué)功能障礙與縫隙連接蛋白Connexin31(Cx31)之間的關(guān)系，為探討噪聲性聾的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物及分組 采用成年雄性Balb/c小鼠44只(購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重約8～11 g，隨機(jī)分為噪聲組和對(duì)照組，每組各22只。噪聲組小鼠給予高強(qiáng)度白噪聲暴露(115 dB SPL，6 h/d，共2天，12 h)，對(duì)照組不予噪聲暴露。

1.2主要試劑 兔抗小鼠Cx31多克隆抗體(Invitrogen, USA)，Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(康維世紀(jì))，5%正常山羊血清封閉液(武漢博士德)，Trizol(Invitrogen, USA)，反轉(zhuǎn)錄試劑采用PrimeScript?RT Master Mix Perfect Real Time(TaKaRa)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑采用SYBR?Premix Ex TaqTM II Perfect Real Time(TaKaRa)，以GAPDH為內(nèi)參照，引物由寶生物工程公司設(shè)計(jì)，序列如下： Gjb3上游5’-cgggtgctggtgtatgtggt -3’，下游5’-gatgttggagatggggaagaag -3’；GAPDH上游5’-tgtgtccgtcgtggatctga-3’，下游5’-ttgctgttgaagtcgcaggag-3’。

1.3主要儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，正置熒光顯微鏡(OLYMPUS)，動(dòng)物噪聲刺激箱，冰凍切片機(jī)(LEICA CM1850)，ABR儀(Bio-logic SYSTEMS CORP)，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad IQ5)。

1.4建立小鼠噪聲性聾模型 噪聲組22只小鼠放在特制鼠籠中，每只小鼠都有獨(dú)立空間，不會(huì)聚集在一起以免影響造聾效果。將鼠籠放入動(dòng)物噪聲刺激箱中，動(dòng)物噪聲刺激箱連接聲音放大器，噪聲由電腦軟件產(chǎn)生并控制，每次給予噪聲前均用校準(zhǔn)器進(jìn)行校準(zhǔn)。噪聲設(shè)置為白噪聲，強(qiáng)度115 dB SPL，每天6小時(shí)共2天。

1.5ABR檢測(cè) 于兩組小鼠實(shí)驗(yàn)前及噪聲暴露結(jié)束后1小時(shí)檢測(cè)ABR反應(yīng)閾。具體方法如下：于靜電屏蔽室內(nèi)，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥深度麻醉后，將記錄電極置于前額正中皮下，參考電極置于待測(cè)耳后皮下，接地電極置于尾部皮下。給予click聲刺激，疊加1 024次，刺激率為每秒13次，濾波帶寬為100～3 000 Hz。測(cè)試從90 dB SPL開(kāi)始，降幅為5 dB，以引出波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾。

1.6冰凍切片制備 噪聲暴露后4小時(shí)，取噪聲組及對(duì)照組小鼠各4只，用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，經(jīng)4%多聚甲醛心臟灌注后取出耳蝸，解剖顯微鏡下去除鐙骨，挑破圓窗膜及卵圓窗膜，用玻璃吸管向窗內(nèi)反復(fù)吹吸，浸入4%多聚甲醛液內(nèi)4 ℃過(guò)夜，常規(guī)脫鈣脫水后，行冰凍切片，片厚10 μm。

1.7間接免疫熒光染色 冰凍切片晾干后經(jīng)0.01 M PBS清洗，滴加5%正常山羊血清封閉液室溫放置1小時(shí)；滴加兔抗小鼠Cx31多克隆抗體(1：250)后4 ℃過(guò)夜。翌日用0.01 M PBS清洗后避光滴加Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1：800)，并置于37 ℃孵育40 min；0.01 M PBS清洗后避光滴加Hochest(1:1 000)襯染胞核；陰性對(duì)照以0.01 M PBS代替一抗，其余步驟同上。甘油封片后熒光顯微鏡下觀察，胞膜呈明亮的紅色熒光為表達(dá)陽(yáng)性，根據(jù)其紅色熒光的明亮程度來(lái)判斷表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.8熒光實(shí)時(shí)定量PCR 小鼠行ABR檢測(cè)后，在噪聲暴露后4小時(shí)內(nèi)，將噪聲組及對(duì)照組小鼠各18只頸椎脫臼處死，立即于冰上取出耳蝸外側(cè)壁組織，取出后迅速放入預(yù)冷的Trizol中。組織稱重使噪聲組和對(duì)照組的組織量相近，分別抽提總RNA并進(jìn)行核酸定量。各組樣本均吸取1 μl總RNA，分別加入反轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，隨后各樣本分別以1 μl cDNA為反應(yīng)模板，加入SYBR Premix Ex Taq II 10 μl，上游及下游引物各0.5 μl，dH2O 8 μl，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，55 ℃ 20 s，循環(huán)40次。本實(shí)驗(yàn)以管家基因GAPDH在小鼠耳蝸外側(cè)壁的mRNA表達(dá)量為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量的2—△△Ct方法對(duì)數(shù)據(jù)加以分析，檢測(cè)兩組小鼠耳蝸外側(cè)壁Cx31編碼基因GJB3的mRNA表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)的收集主要由PCR擴(kuò)增儀自帶軟件完成，最終比較各組樣本GJB3/GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1ABR反應(yīng)閾 實(shí)驗(yàn)前兩組小鼠的ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，噪聲暴露后噪聲組小鼠ABR反應(yīng)閾分別與噪聲暴露前和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(表1)。

表1 兩組小鼠實(shí)驗(yàn)前、后ABR反應(yīng)閾

注：與同組實(shí)驗(yàn)前及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后比較，P<0.01

2.2間接免疫熒光染色觀察 熒光顯微鏡下可見(jiàn)，對(duì)照組小鼠耳蝸外側(cè)壁內(nèi)有Cx31表達(dá)，Cx31特異性熒光主要集中表達(dá)在螺旋韌帶的Ⅰ型纖維細(xì)胞，部分Ⅲ型纖維細(xì)胞也有表達(dá)，在表達(dá)密集處會(huì)融合成斑片狀，血管紋內(nèi)未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。噪聲組小鼠耳蝸螺旋韌帶處可見(jiàn)Cx31特異性熒光，但明顯低于正常組(圖1、2)。

圖1 對(duì)照組小鼠耳蝸外側(cè)壁免疫熒光染色(×400)

Cx31主要表達(dá)在與血管紋毗鄰的螺旋韌帶Ⅰ型纖維細(xì)胞，在部分Ⅲ型纖維細(xì)胞也有表達(dá)。在表達(dá)密集處會(huì)融合成斑片狀。在血管紋處未見(jiàn)特異性熒光

圖2噪聲組小鼠耳蝸外側(cè)壁免疫熒光染色(×400)

螺旋韌帶處特異性熒光明顯減弱，只有少量Ⅰ型纖維細(xì)胞表達(dá)Cx31

2.3熒光實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，噪聲組小鼠GJB3/GAPDH相對(duì)表達(dá)量為0.170 5±0.091 5，對(duì)照組GJB3/GAPDH相對(duì)表達(dá)量為1.369 6±0.302 7，對(duì)照組是噪聲組的8倍。噪聲組小鼠耳蝸外側(cè)壁GJB3的平均表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

縫隙連接蛋白是一種膜蛋白，廣泛存在于各種組織中，它具有四個(gè)跨膜區(qū)，其C端長(zhǎng)度具有高度變異性。六個(gè)縫隙連接蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或高爾基體中經(jīng)寡聚化后形成一個(gè)半通道，經(jīng)胞內(nèi)的微管泡網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)膜[6]，從而與相鄰細(xì)胞形成縫隙連接。這六個(gè)連接蛋白可以相同也可以不同，同型的半通道可以相互對(duì)接形成縫隙連接，也可以選擇性的與異型的半通道對(duì)接，這種特殊的組合方式使縫隙連接蛋白很可能具有連接作用以外的其他功能。細(xì)胞間的縫隙連接中間形成微管，允許離子如Ca2+、Mg2+、K+通過(guò)，以及分子量小于1 KDa的小分子通過(guò)，如ATP、cAMP、cGMP、IP3等?？p隙連接的通道由縫隙連接蛋白構(gòu)成，目前已知在哺乳類動(dòng)物中，人類有21種縫隙連接蛋白，小鼠有20種[7]。

目前，關(guān)于Cx31的研究主要集中在Cx31突變引起的聽(tīng)力障礙以及變異性紅斑角化病(EKV)，而在Cx31未突變的情況下，噪聲致聾后耳蝸功能障礙與Cx31之間有何種相互作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察到Cx31在正常成年小鼠耳蝸中有表達(dá)，Cx31主要表達(dá)在與血管紋毗鄰的螺旋韌帶Ⅰ型纖維細(xì)胞，在部分Ⅲ型纖維細(xì)胞也有表達(dá)；給予噪聲刺激后，Cx31在Ⅰ型纖維細(xì)胞的表達(dá)減少，在Ⅲ型纖維細(xì)胞幾乎沒(méi)有表達(dá)，這與文獻(xiàn)[8～10]中報(bào)道的結(jié)論一致。Spicer等[11]的觀察結(jié)果顯示，在沙鼠耳蝸外側(cè)壁有Na,K-ATP酶、碳酸酐酶和肌酸激酶等離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)酶表達(dá)，Ⅰ型和Ⅲ型纖維細(xì)胞均沒(méi)有Na,K-ATP酶表達(dá)，而只表達(dá)碳酸酐酶和肌酸激酶。因此推測(cè)，螺旋韌帶的縫隙連接，尤其是與血管紋毗鄰的部分螺旋韌帶中的縫隙連接在離子轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮了重要作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，持續(xù)高強(qiáng)度噪聲刺激會(huì)損傷耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞，最終導(dǎo)致聽(tīng)閾位移。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12,13]中常用的噪聲暴露條件，并適當(dāng)延長(zhǎng)暴露時(shí)間，結(jié)果顯示，噪聲暴露前噪聲組與對(duì)照組小鼠的ABR閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在給予高強(qiáng)度噪聲后，噪聲組的ABR閾值升幅達(dá)到45 dB，明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用的噪聲暴露條件建立小鼠噪聲性聾成功，且造成的閾移短期內(nèi)不易恢復(fù)。

縫隙連接在細(xì)胞間形成孔道，使相鄰細(xì)胞間可以直接進(jìn)行物質(zhì)交換及胞間通訊，因而在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中有重要作用。在內(nèi)耳中，縫隙連接參與了內(nèi)淋巴電位(EP)的產(chǎn)生和維持。內(nèi)耳中存在兩套縫隙連接系統(tǒng)，一個(gè)是上皮組織縫隙連接系統(tǒng)，主要由Corti器支持細(xì)胞、骨螺旋板緣的齒間細(xì)胞(interdental cell)和螺旋韌帶的根細(xì)胞(root cell)組成；另一個(gè)是結(jié)締組織縫隙連接系統(tǒng)，由血管紋中間細(xì)胞、血管紋基底細(xì)胞、螺旋韌帶纖維細(xì)胞、連接聽(tīng)泡骨質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)暗細(xì)胞和骨螺旋板緣的纖維細(xì)胞組成[14,15]。關(guān)于鉀離子內(nèi)淋巴循環(huán)在EP產(chǎn)生中的作用，有學(xué)者提出，鉀離子離開(kāi)毛細(xì)胞后，通過(guò)上皮細(xì)胞縫隙連接系統(tǒng)進(jìn)入毛細(xì)胞外側(cè)的其它Corti器細(xì)胞中，經(jīng)螺旋韌帶的Ⅱ型纖維細(xì)胞攝入后，通過(guò)結(jié)締組織細(xì)胞縫隙連接系統(tǒng)進(jìn)入血管紋，隨后被分泌入內(nèi)淋巴[16]。文中結(jié)果顯示，噪聲暴露后小鼠耳蝸外側(cè)壁Cx31表達(dá)量明顯下降，其表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的1/8，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，推測(cè)噪聲引起了耳蝸外側(cè)壁的縫隙連接系統(tǒng)功能障礙，從而影響鉀離子的循環(huán)途徑，進(jìn)而引起EP改變。而Cx31究竟在上述過(guò)程中發(fā)揮何種作用及如何發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

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