大鼠百草枯中毒肺內炎癥因子表達﹡

西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院急診科（西安710004） 王小闖 高 欣 古長維 黨曉燕

大鼠百草枯中毒肺內炎癥因子表達﹡

西安交通大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院急診科（西安710004） 王小闖 高 欣△古長維 黨曉燕

目的：測量百草枯中毒后大鼠血清中炎癥因子的水平。方法：將96只大鼠隨機分為陰性對照組、高劑量染毒組 （120mg／kg）、中劑量染毒組（60mg／kg）和低劑量染毒組（30mg／kg），每組24只大鼠。實驗分8、24、72h三個時間段進行觀察。應用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測量血清TGF－β1、TNF－a、IL－10濃度。將大鼠肺進行病理切片及 Masson染色觀察肺纖維化情況。結果：隨染毒時間延長，各劑量組細胞因子水平逐漸增加，24、72h組與對照組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。72h高劑量組各指標與同時間點低劑量組比較均有顯著性差異（P＜0.05）。72h高、中、低3個劑量組與8h時間點比較有顯著性差異（P＜0.05）。大鼠肺組織中出現(xiàn)炎性粒細胞浸潤，廣泛彌漫的間質纖維化表現(xiàn)。Masson染色，24h后肺組織中分泌纖細的膠原纖維，72h后可見到大量藍染的膠原纖維。結論：大鼠百草枯中毒后TGF－β1、TNF－a、IL－10等炎癥因子水平顯著升高。

百草枯是廣泛使用的有機雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑，易溶于水，微溶于酒精，可被堿水解，惰性黏土和陰離子表面活性能使其鈍化。百草枯與血漿蛋白結合很少，且不經代謝，在腎小管中不被重吸收，以原形從腎臟排出，但其能夠被肺選擇性攝入。百草枯對人畜有較強毒性，如經皮膚接觸、呼吸道吸人及誤服均可造成急性中毒。百草枯不僅可以引起肺纖維化，還可以導致MODS，不論是肺纖維化或是MODS均有炎癥因子參與其中，本實驗就其炎癥因子的表達進行了相關研究。

材料與方法

1 動物與分組 成年健康Wistar大鼠（由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供）96只，雌雄各半，體重250g±30g 隨機分為對照組、高劑量染毒組（120mg／kg）、中劑量染毒組（60mg／kg）和低劑量染毒組（30mg／kg）四組，每組24只大鼠。

2 實驗與觀察 染毒組給予相應劑量的百草枯溶液lml灌胃，并對陰性對照組同時給予1ml蒸餾水。每組按染毒后時間又分為8h、24h、72h三個亞組。染毒前及染毒后給予大鼠正常飼料及飲水。分別于8、24、72h時間段對各組實驗動物的大體變化進行觀察，各組動物均于觀察結束后采用下腔靜脈穿刺取血約5ml，靜置20min，離心后取血清，－70℃凍存，待檢測，抽血后處死大鼠，大鼠處死后，立即解剖取肺組織進行病理實驗。

3 血清 TGF－β1、TNF－a、IL－10濃度測定 TGF－

β1、TNF－a、IL－10試劑盒由美國 R＆D公司進口分裝，上海森雄科技實業(yè)有限公司提供；血清TGF－β1、TNF－a、IL－10濃度采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行測定，按試劑盒有關說明進行操作。

4 統(tǒng)計學處理 本組所有實驗數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各參數以均值±標準差（x±s 表示。經正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗，滿足正態(tài)性與方差齊性的數據作完全隨機設計的方差分析，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結 果

1 動物大體變化 染毒大鼠于染毒后不同時間出現(xiàn)煩躁、易激惹、少動、萎靡、厭食、毛蓬松、呼吸急促表現(xiàn)，各劑量組8、24h無動物死亡，高劑量組72h有2只動物死于呼吸衰竭。

2 細胞因子變化 見附表及圖1～4。隨染毒時間的延長，各劑量組細胞因子水平逐漸增加，染毒后24、72h與8h各組比較，均有顯著性差異（P＜0.05）；72h高劑量組各指標與同時間點低劑量組比較也有顯著性差異（P＜0.05）；72h高、中、低3個劑量組與對照組相同時間點比較有顯著性差異（P＜0.05）。提示隨染毒濃度的增加細胞因子水平逐漸增加，隨時間的延長細胞因子的水平也逐漸增加，存在有一定的線性趨勢，在整個試驗過程中表現(xiàn)出動態(tài)的變化。

附表 各組大鼠血清炎癥因子含量（±s）

附表 各組大鼠血清炎癥因子含量（±s）

注：＊細胞因子含量與8h組比較明顯改變（P＜0.05）；△細胞因子含量與同時間點低劑量組比較明顯改變（P＜0.05）；＃細胞因子含量與對照組比較明顯改變（P＜0.05）

組 別 監(jiān)測指標 染毒后8h 染毒后24h 染毒后72h對照組 TGF－β1 67.49±21.53 64.93±23.68 62.50±25.71 TNF－α 34.73±6.31 32.93±6.13 38.46±6.74 IL－10 21.95±4.18 24.25±4.57 23.55±4.15低劑量組 TGF－β1 397.54±94.38 443.46±114.98＊ 954.83±189.25＊＃TNF－α 35.39±6.22 42.64±9.20＊ 49.28±10.32＊＃IL－10 23.03±5.23 30.33±6.42＊ 48.42±8.34＊＃中劑量組 TGF－β1 498.35±185.39 927.42±158.39＊ 1278.84±289.35＊＃TNF－α 36.82±7.24 49.68±9.35＊ 74.22±13.84＊＃IL－10 24.20±5.23 36.80±8.92＊ 58.25±10.17＊＃高劑量組 TGF－β1 623.20±189.35△ 1053.97±298.58＊△ 1387.98±395.38＊△＃TNF－α 41.05±9.24△ 52.20±14.63＊△ 92.38±13.12＊△＃IL－10 28.39±5.35△ 29.85±8.53＊△ 40.28±10.48＊△＃

3 病理改變 肉眼觀察，PQ染毒后自8h起，肺即出現(xiàn)腫脹，顏色變?yōu)榘导t，肺臟重量隨著中毒時間的延長，逐漸加重；并且伴有彌漫性出血，部分大鼠甚至有滿肺腫脹出血。HE染色切片觀察，染毒后8h出現(xiàn)肺泡毛細血管的擴張充血，內皮細胞腫脹，繼而出現(xiàn)以中性白細胞為主的炎細胞浸潤，肺泡腔內充血有蛋白水腫液的滲出；染毒后24h肺泡毛細血管擴張更加明顯，有大量滲出液及炎性粒細胞的浸潤，同時肺泡腔內滲出液開始機化；染毒后72h滲出更加廣泛和彌漫，出現(xiàn)廣泛彌漫的間質纖維化的表現(xiàn)。

討 論

特發(fā)性肺纖維化的形成與眾多細胞因子有關［1，2］。由淋巴細胞和巨噬細胞產生的活化的成纖維細胞刺激因子在百草枯誘導的肺間質纖維化形成過程中起重要作用，從活化脾細胞培養(yǎng)的刀豆素中提取的含有豐富淋巴因子的上清液，可明顯抑制百草枯誘導的肺纖維化及伴發(fā)的炎癥反應。給鼠灌入百草枯（30mg kg后12h，肺泡灌洗液中白三烯B4（LTB4）明顯升高，而在百草枯灌人后8h再給予N－乙酞半朧氨酸（50mg／kg）則抑制LTB4升高。有關細胞因子與特發(fā)性肺纖維化關系研究較多，但百草枯誘導的肺間質纖維化與細胞因子的關系國內外報道較少。

在肺損傷的早期巨噬細胞分泌TGF－βl，可刺激成纖維細胞增殖和分化。隨著肺纖維化的進展，成纖維細胞以自分泌的方式產生 TGF－βl，所分泌的 TGF－βl以旁分泌的方式與肺間質相互作用，促使間充質干細胞增殖和分泌細胞外基質［3］。

近年來有文獻提出并解釋肺纖維化細胞因子網絡的概念，產生細胞因子的細胞有肺巨噬細胞（肺泡型細胞、中性粒細胞、上皮細胞和毛細血管內皮細胞等。在肺損傷時，M 小來源的細胞因子有IL－10、TNF－α［4］，這些細胞生長因子一方面使炎癥細胞浸潤，分化和成熟；另一方面促進細胞因子和炎癥遞質的進一步分泌和表達，形成復雜的細胞因子網絡，引起肺泡炎和肺損傷。IL－lp的生物活性與TNF－α十分相似，對巨噬細胞及中性粒細胞有趨化和豁附作用，可增強血管通透性，并促進TNF－α所導致的組織損傷。IL－10主要由Th Z細胞產生，也可由單核／巨噬細胞產生，其主要的生物學特性是抑制IL－2、干擾素（IFN）－Y、TGF－α產生，能調節(jié)T細胞的功能，促進細胞毒性T淋巴細胞誘導、增強B細胞的增殖和分比，IL－10可減輕炎癥反應，減少膠原的產生，有助于控制炎癥，維持機體的穩(wěn)態(tài)，是損傷的一種代償反應。本次研究結果表明，百草枯染毒后，大鼠血清中細胞因子TNF－α、IL－10水平明顯增加，隨染毒時間的延長其表達水平也增加，存在有一定的線性趨勢，在整個試驗過程中表現(xiàn)出動態(tài)的變化，說明在百草枯染毒的大鼠模型中，TGF－β1IL－10 TNF－α細胞因子的水平與肺纖維化的發(fā)生可能密切相關，并形成了復雜的細胞因子網絡，調控肺泡上皮細胞和間質成纖維細胞的增殖和凋亡，使細胞外基質的積逐漸增多，抑制纖溶系統(tǒng)的激活，最終促使肺纖維化的形成［5］。

總之，本研究提示在百草枯中毒發(fā)病過程中，細胞因子 TGF－β1、IL－10、TNF－α表現(xiàn)明顯的劑量依賴，隨著染毒濃度的增加，細胞因子表達的改變出現(xiàn)變化，并隨著時間的改變呈改變，然而其作用的具體機制尚需進一步研究。

［1］ Ortiz L A，Lasky J，Hamilton R F，et al.Expression of TNF and the necessity of TNF receptors in bleomycin－induced lung injury in mice［J］.Exp Lung Res，1998，24（6）：721－743.

［2］ 韋小瑜.細胞因子與肺纖維化 ［J］.西南軍醫(yī)，2006，8（2）：54－57.

［3］ Ruiz V，Ordonez RM，Berumen J，et al.Unbalanced collagenases／TIMP－1 expression and epithelial apoptosis in experimental lung fibrosis［J］.Am J Physiol，2003，285（5）：1026－1036.

［4］ Song M，He B，Qiu Z.Expressions of TNF alpha，PDGF in alveolar type II epithelial cells of rats with bleomycin－induced pulmonary fibrosis［J］.Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，1998，21（4）：221－223.

［5］ AIai T，Abe K，Matsuoka H，et al.Introduction of the Interleukin－10gene into mice inhibited bleomycin－induced lung injury in vivo ［J］.Am J Physiol Long Cell Mol Physiol，2000，278（5）：914－922 .

The expression of pulmonary inflammatory factor in paraquat poisoning rats

Department of Emergency，the Second Affiliated Hospital of Medical College，Xi’an Jiaotong University（Xi’an 710004） Wang Xiaochuang Gao Xin Gu Changwei et al

Objective：To measure serum levels of inflammatory factors in paraquat poisoned rats.Methods：96 rats were grouped in accordance with the randomly principle.They were divided into control group and high dose exposure group（120mg／kg），middle dose exposure group（60mg／kg）and low－dose exposure group（30mg／kg），n＝24 rats.Experimental were divided into8，24，72 h points for observation.Used enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）measurement to measure serum TGF－β1，TNF－a，IL－10 concentration.The rats lung were used biopsy and Masson staining to observe pulmonary fibrosis.Results：With the exposure time，each dose group the levels of cytokines gradually increased.24，72 h compared with the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.The every target in 72h high dose group with the same point compared with lowdose group was significantly（P ＜0.05）.72h high，medium and low－dose group compared with the 8h time group was statistically significant（P ＜0.05）.Rat lung tissue infiltration appears inflammatory granulocytes，extensive diffuse interstitial fibrosis of the performance.Conclusion：In paraquat poisoned rats，theinflammatory cytokine of TGF－β1，TNF－a，IL－10 levels were significantly increased.

Poisoning／physiopathology Chemokines／metabolism Animals，laboratory Rats

中毒／病理生理學 炎癥趨化因子類／代謝 動物，實驗 大鼠

R595.4

A

1000－7377（2012）09－1107－03

﹡ 陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目（No 2012k16－01－03）

△ 陜西省人民政府機關門診部

（收稿：2012－03－20）