蔣新格 趙晨陽(yáng) 樊 興 陳子龍 黨如意 陳 玲

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,重慶 400016)(2. 重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,重慶 400016)(3.重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，重慶 400016)

我國(guó)是世界上最大的煙草生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，吸煙是我國(guó)目前最突出的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1-2]。隨著近年來(lái)空氣中的PM2.5等可吸入粉塵顆粒對(duì)人體呼吸道系統(tǒng)的影響越來(lái)越大，因此對(duì)于環(huán)境中煙霧的污染造成呼吸道系統(tǒng)疾病的研究成為目前學(xué)術(shù)探討的熱點(diǎn)[3-7]。煙霧染毒的方法作為研究各類(lèi)疾病的重要手段，動(dòng)物染毒實(shí)驗(yàn)是否成功直接關(guān)系著實(shí)驗(yàn)的成敗。隨著儀器技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在市面上有染毒效果良好的染毒柜出售，但是染毒柜因?yàn)閮r(jià)格高，操作復(fù)雜等原因讓許多科研機(jī)構(gòu)、學(xué)校等不能選擇。雖然除了染毒柜，目前也有許多其他的簡(jiǎn)易染毒方式可以選擇，但是現(xiàn)有的染毒方法很多無(wú)法排除因缺氧，溫度等干擾因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活率的影響，這樣會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物意外死亡率增高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)喪失，減弱了實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力。因此研究一種新式簡(jiǎn)易的煙霧染毒方法是開(kāi)展研究煙霧導(dǎo)致相關(guān)疾病實(shí)驗(yàn)室的亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

為了解決這一問(wèn)題，本文在原有的染毒方法基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一個(gè)新型的箱狀實(shí)驗(yàn)裝置。使用壓縮空氣泵向箱體內(nèi)注入氧氣，通過(guò)控制氧氣的吸入及排出，使得實(shí)驗(yàn)裝置更加穩(wěn)定。為今后能設(shè)計(jì)出方便控制氧氣流入，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性的簡(jiǎn)易染毒裝置提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用SPF級(jí)雌性昆明系小鼠160只，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可編號(hào)：SCXK(渝)2017-0001。主要試劑為五牛牌香煙。

1.2 染毒裝置的組成

本裝置用可封閉染毒箱為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行場(chǎng)所，染毒箱左右兩側(cè)各開(kāi)一孔，且對(duì)稱(chēng)分布，兩孔為香煙燃燒煙霧進(jìn)入的孔道。染毒箱底部正中開(kāi)一孔，為壓縮空氣泵通空氣入口。點(diǎn)燃香煙由兩孔送入煙霧，因兩側(cè)通入煙霧量相同，兩孔對(duì)稱(chēng)分布且染毒箱封閉性好，可保證染毒箱里煙霧濃度恒定。底部孔用壓縮空氣泵連接長(zhǎng)管通入空氣。簡(jiǎn)易裝置如圖1所示。

圖1 改良煙霧染毒箱示意圖Fig.1 The schematic diagram of improved smoke poison box

1.3 方法

1.3.1分組及染毒： 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組40只小鼠(雌雄各半)。染毒1組小鼠60只(雌雄各半)分籠置于染毒箱內(nèi)，采用呼吸道靜式染毒。染毒2組小鼠60只(雌雄各半)分籠置于改良后的染毒箱內(nèi)，采用呼吸道靜式染毒，同時(shí)開(kāi)啟壓縮氣泵通過(guò)底部管道運(yùn)送空氣入染毒箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行1個(gè)月，每日染毒1次，每次進(jìn)行2 h，每日染毒給藥分7次，每次點(diǎn)燃2支香煙，香煙燃盡后再補(bǔ)充同樣劑量的兩支香煙于左右兩煙霧孔，疊加后總用量為14支。點(diǎn)燃香煙置于染毒箱上兩孔。對(duì)照組小鼠每日相同時(shí)間被放置于染毒箱內(nèi)，但未進(jìn)行染毒。實(shí)驗(yàn)期間觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的情緒狀態(tài)。

1.3.2標(biāo)本采集及處理：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄小鼠死亡及生命體征異?，F(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用斷頸法處理剩余小鼠。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

對(duì)照組小鼠生命體征正常，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)敏捷，體質(zhì)量增加明顯；染毒組小鼠精神狀態(tài)較差，倦怠懶動(dòng)，出現(xiàn)不同程度的飲食飲水量減少，其中染毒1組出現(xiàn)不良反應(yīng)更為明顯。染毒期間可見(jiàn)染毒箱內(nèi)溫度隨染毒時(shí)間的增加而有輕微的升高。

2.2 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況

在相同時(shí)間里，經(jīng)過(guò)不同的染毒方式，小鼠均有不同程度的死亡。在染毒30 d后，染毒1組小鼠死亡數(shù)15只，染毒2組雄鼠死亡數(shù)為6只。染毒1組小鼠存活率顯著低于染毒2組小鼠，小鼠存活率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=7.647P=0.02<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存活情況Table 1 The survivle rate of the experimental animals

2.3 各染毒小組染毒過(guò)程中染毒箱氧氣濃度變化

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第1、6、12、18、24、30天時(shí)，分別對(duì)染毒1組和染毒2組在每次染毒結(jié)束前對(duì)其染毒箱內(nèi)氧濃度含量百分比進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2。染毒1組的箱內(nèi)平均氧濃度含量百分比為(16.03±1.03)%，染毒2組箱內(nèi)平均氧濃度含量百分比為(18.68+0.31)%，染毒1組裝置內(nèi)的氧濃度含量明顯低于染毒2組氧濃度，且染毒2組裝置內(nèi)的氧濃度含量波動(dòng)小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.260，P=0.045<0.05)。

表2 各組染毒箱內(nèi)氧濃度含量百分比Table 2 Percentage of oxygen concentration in each infected box

2.4 總懸浮顆粒物(TSP)濃度

每日染毒時(shí)，分7次燃煙，每次點(diǎn)燃2支，且在每次染毒結(jié)束后用粉塵采樣器測(cè)量各組染毒箱內(nèi)TSP濃度，進(jìn)行結(jié)果的對(duì)比見(jiàn)表3。結(jié)果顯示染毒1組和染毒2組裝置內(nèi)的TSP濃度差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明改進(jìn)的煙霧染毒裝置不影響毒物的劑量和染毒過(guò)程。

表3 染毒各組染毒箱TSP濃度對(duì)比Table 3 Comparision of TSP concentration in each infected group

3 討論

目前對(duì)于進(jìn)行簡(jiǎn)易煙霧吸入性損傷動(dòng)物模型的研究大部分是將煙霧直接釋放到相對(duì)封閉的染毒箱內(nèi)[8]，無(wú)法避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物非實(shí)驗(yàn)效果死亡，比如缺氧、溫度過(guò)高等不利因素影響。市面上雖然有販賣(mài)的染毒柜，但是價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，對(duì)技術(shù)要求高，工作量較大[9]。楊永國(guó)等[10]在運(yùn)用靜式染毒法對(duì)正己烷吸入致大鼠肺和肝腎損害的研究中進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)探究，因防止毒氣外溢使用封閉染毒箱，但封閉環(huán)境必然會(huì)導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中染毒箱中氧氣量下降，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸受阻，最終可能使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物非實(shí)驗(yàn)效果死亡。何志義等[11]在研究香煙對(duì)小鼠C2C12成肌細(xì)胞分化的影響中采用簡(jiǎn)易冷凝裝置收集香煙煙霧液體，再直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，這種方法沒(méi)有能夠真實(shí)地模擬煙霧對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的影響，煙霧和煙霧液體兩種物理形態(tài)也可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象產(chǎn)生不同的實(shí)驗(yàn)效果。因此，我們期望在簡(jiǎn)易染毒箱的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，使其成本低廉、制作簡(jiǎn)單、配氣精確,可以重復(fù)使用,能夠滿(mǎn)足動(dòng)式染毒實(shí)驗(yàn)需求，使之既方便又能有效地達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

本研究發(fā)現(xiàn)，染毒1和染毒2組小鼠精神狀態(tài)均較差,倦怠懶動(dòng),甚至出現(xiàn)昏迷等不良反應(yīng)，在染毒過(guò)程中出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而且研究發(fā)現(xiàn)染毒1組小鼠的不良反應(yīng)更嚴(yán)重，且死亡率顯著高于染毒2組，又由于染毒1組氧濃度明顯低于染毒2組，因此可以推測(cè)缺氧是導(dǎo)致小鼠非實(shí)驗(yàn)因素死亡的一個(gè)重要因素，本研究中隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，染毒箱內(nèi)的溫度有輕微的升高，因此也不排除動(dòng)物死亡有可能是缺氧和溫度升高共同作用的結(jié)果。

簡(jiǎn)易染毒裝置是在普通染毒箱的基礎(chǔ)上改進(jìn)了對(duì)氧濃度的調(diào)控和溫度的監(jiān)測(cè)而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明染毒1和染毒2組的裝置內(nèi)的TSP濃度變化無(wú)明顯差異，避免了改良設(shè)備對(duì)染毒劑量本身的影響。在不改變煙霧濃度的情況下，極大地提高了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物非藥理性的存活率，為實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)進(jìn)行提供了可能。因此，改良后的簡(jiǎn)易染毒箱具有較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)可行性。

吸煙造成的煙霧和環(huán)境中的總懸浮顆粒，例如PM2.5等粉塵顆粒與呼吸系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但至今對(duì)其致病機(jī)制仍不是很清楚[11]。近年來(lái)越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注煙霧引起疾病的機(jī)制研究[12-14]，同時(shí)目前很多大學(xué)生也在開(kāi)展這個(gè)方面的自主創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)，成功地制作煙霧染毒動(dòng)物模型是研究的關(guān)鍵一步，張素萍等人[15]在《香煙煙霧氣體體外染毒方法的建立》一文中提到國(guó)內(nèi)已經(jīng)研制出TRANSWELL膜技術(shù)，可使細(xì)胞直接暴露于各種氣體環(huán)境進(jìn)行染毒，但由于此技術(shù)還不成熟且價(jià)格昂貴，使許多欲使用者止步不前。本文改進(jìn)制作的簡(jiǎn)易染毒箱可以運(yùn)用于煙霧染毒模型的構(gòu)建，實(shí)驗(yàn)成本低廉，實(shí)踐性極高。