胡秀榮黃振東蒲占湑杜丹超鹿連明陳國(guó)慶

（浙江省柑橘研究所臺(tái)州黃巖318020）

柑橘內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

胡秀榮黃振東蒲占湑杜丹超鹿連明陳國(guó)慶

（浙江省柑橘研究所臺(tái)州黃巖318020）

植物內(nèi)生菌是指生活于健康植物組織內(nèi)部不引發(fā)植物明顯病癥的微生物，但在植物衰老或外界刺激條件下，植物自身免疫力下降，也可能出現(xiàn)某些病癥；植物內(nèi)生菌主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌等[1]。本文主要綜述了柑橘內(nèi)生菌的最新研究進(jìn)展，包括內(nèi)生菌的分離方法、種類及生物防治方面的應(yīng)用進(jìn)展情況。

1 柑橘內(nèi)生細(xì)菌

1.1 植物內(nèi)生細(xì)菌一般分離方法

由于內(nèi)生菌廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的組織中，所以分離時(shí)可以采集健康的植株，然后對(duì)樣品進(jìn)行一系列的表面消毒，其中包括酒精、次氯酸鈉、高錳酸鉀、升汞等消毒劑進(jìn)行表面消毒，最后用無菌水沖洗干凈，將消毒好樣品進(jìn)行無菌研磨，加入少量無菌水，吸取汁液涂平板，待長(zhǎng)出細(xì)菌后，進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，最后一次沖洗水涂板檢測(cè)表面消毒是否徹底。此外消毒劑選擇和消毒的時(shí)間應(yīng)根據(jù)樣品的軟硬程度確定[1]，Samish等曾對(duì)不用消毒技術(shù)進(jìn)行比較，并形成標(biāo)準(zhǔn)化程序[2]。

1.2 柑橘內(nèi)生細(xì)菌的研究應(yīng)用

柑橘內(nèi)生細(xì)菌的研究主要集中于柑橘內(nèi)生細(xì)菌分離及對(duì)柑橘炭疽病、潰瘍病和油菜菌核病等幾種病害的拮抗作用研究。如羅永蘭，張志元等[3]從溫州蜜柑、甜橙、玉環(huán)柚三個(gè)品種采集支根、主干皮層、一年生枝條、葉片、果實(shí) 5種器官作為分離材料進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，結(jié)果分離出75份內(nèi)生細(xì)菌，分別屬于氣芽孢桿菌屬(Aerobacillus sp.)、氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、黃單孢桿菌屬(Xanthomonasspp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonasspp.)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)、乳桿菌屬( Lactabacillussp.)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌在不同品種和不同器官中出現(xiàn)的頻率不同。羅永蘭等[4]對(duì)柑橘拮抗內(nèi)生細(xì)菌生物學(xué)特性和抗菌產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性也進(jìn)行了相關(guān)研究。2004年冉國(guó)華等[5]研究了柑橘內(nèi)生拮抗細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)油菜菌核病的田間防治效果，發(fā)現(xiàn)兩株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)抑制油菜菌核病病斑擴(kuò)大有一定效果,但效價(jià)不是很高,有必要作進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。余建等[6]研究了柑橘內(nèi)生拮抗細(xì)菌在油菜上的定殖及對(duì)油菜菌核病防效，發(fā)現(xiàn)拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)菌核病有較好的抑制效果，并可以從根部進(jìn)入油菜植株內(nèi)定殖，屬于較為理想的生防菌。2005年袁紅旭等[7]從不同品種柑橘果實(shí)中分離出16株內(nèi)生細(xì)菌，從中篩選出 4株對(duì)柑橘炭疽病有較好防治作用的拮抗內(nèi)生細(xì)菌，其中 1株具有顯著促進(jìn)柚苗生長(zhǎng)作用，但沒有闡明所分離到內(nèi)生細(xì)菌的分類地位。2005年譚小艷等[8]從中國(guó)南寧柑橘葉片中分離到對(duì)柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的細(xì)菌菌株，鑒定為洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia），同時(shí)該菌對(duì)其他作物病害的防治也有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2 柑橘內(nèi)生真菌

2.1 植物內(nèi)生真菌的分離方法

內(nèi)生真菌的分離同樣要經(jīng)過嚴(yán)格的表面消毒，去除表面附生菌及環(huán)境中的真菌和細(xì)菌，保證分離到的菌為內(nèi)生菌。分離內(nèi)生真菌的培養(yǎng)基多為常用真菌培養(yǎng)基，如馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基等。內(nèi)生真菌分離過程用于表面消毒劑主要有乙醇、升汞、次氯酸鈉、甲醛等。何佳等[9]報(bào)道采用乙醇浸泡，次氯酸鈉浸泡，無菌水漂洗更適合內(nèi)生真菌的分離，因?yàn)榇温人徕c具有較好的揮發(fā)性，且毒性較小，即使有少量次氯酸鈉浸入植物組織中，也會(huì)在平板的培養(yǎng)過程中從植物組織中揮發(fā)出來，而且滅菌后用于培養(yǎng)的植物材料剪去了兩頭褐變氧化部分，所以，次氯酸鈉不易殘留在植物組織內(nèi)影響內(nèi)生真菌從植物材料中長(zhǎng)出。

2.2 柑橘內(nèi)生真菌的研究應(yīng)用

根據(jù)文獻(xiàn)記錄，柑橘內(nèi)生真菌有33個(gè)屬，內(nèi)生真菌的分類鑒定主要通過形態(tài)觀察，而對(duì)不產(chǎn)孢子的內(nèi)生真菌，運(yùn)用分子生物學(xué)等方法進(jìn)行鑒定，以發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的菌株。國(guó)內(nèi)對(duì)柑橘內(nèi)生真菌的分離也進(jìn)行了研究，2008年趙昌會(huì)等[11]從湖南永州柑橘的枝、葉、果實(shí)中分離培養(yǎng)出20株內(nèi)生真菌，對(duì)部分真菌做了分類鑒定，并對(duì)內(nèi)生真菌的拮抗活性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)柑橘內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物多數(shù)具有抗金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的活性。2005年羅永蘭等[12]從不用地區(qū)不同種類上定點(diǎn)多次取樣分離內(nèi)生真菌，分離到柑橘內(nèi)生真菌5642株，大部分進(jìn)行了鑒定，分別屬于24屬，并新發(fā)現(xiàn)15屬，柑橘內(nèi)生真菌表現(xiàn)出豐富的多樣性。目前柑橘內(nèi)生真菌的研究主要集中于內(nèi)生真菌的分離與鑒定，而對(duì)于柑橘內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物的研究還較少，內(nèi)生真菌除了解其抗菌活性外，還可研究其對(duì)病蟲害的防治，對(duì)柑橘樹生長(zhǎng)、果實(shí)產(chǎn)量的影響等，以開發(fā)其在生產(chǎn)上的應(yīng)用價(jià)值。

3 柑橘內(nèi)生放線菌

3.1 植物內(nèi)生放線菌一般分離方法

先在自來水下沖洗掉樣品表面的泥土，再用超聲波清洗；然后用99%乙醇處理 1min，3%次氯酸鈉處理 5min，最后用99%乙醇再處理30 s。滅菌好的材料用無菌刀切成 1cm× 1cm小塊，置于分離培養(yǎng)基表面。同時(shí)，將最后一次處理植物樣品的清洗液涂在ISP 2培養(yǎng)基上，用以檢測(cè)表面滅菌的效果。分離培養(yǎng)基置于27℃濕潤(rùn)的環(huán)境中培養(yǎng) 2～ 6周，待放線菌長(zhǎng)出[13]。

3.2 柑橘內(nèi)生放線菌的研究應(yīng)用

植物內(nèi)生放線菌是一類新的生防微生物資源，在植物病蟲害的防治中具有很大的應(yīng)用潛力。內(nèi)生放線菌作為內(nèi)生菌的重要類群，是較新的研究領(lǐng)域，從中有可能發(fā)現(xiàn)新型活性化合物或提供模板化合物。從目前所研究的植物中分離到的內(nèi)生放線菌大多為鏈霉菌菌屬（Streptomyces），少部分為稀有放線菌。在植物內(nèi)生放線菌的應(yīng)用方面也有很多報(bào)道，主要是在農(nóng)業(yè)上病蟲害的防治及在醫(yī)藥上抗腫瘤作用的研究等。

相對(duì)于柑橘內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌，柑橘內(nèi)生放線菌研究相對(duì)較少，有待研究者進(jìn)行深入研究。

4 展望

植物內(nèi)生菌是相對(duì)未開發(fā)的領(lǐng)域，可能擁有豐富的生物多樣性，全世界共有植物接近300000種，而目前所報(bào)道的用于內(nèi)生菌研究的不過幾百種，內(nèi)生放線菌就更少。由于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，且能產(chǎn)生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質(zhì)，因而能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性。內(nèi)生菌分布于宿主植物組織內(nèi)部，比暴露于外部環(huán)境的附生菌和腐生菌具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，更易于發(fā)揮作用，加之，植物內(nèi)生菌具有一定的宿主專一性，除從其宿主植物吸取養(yǎng)料和對(duì)侵染宿主植物的其它生物起作用外，對(duì)宿主植物本身及其它生物幾乎沒有影響，而且內(nèi)生菌可以通過人工接種被導(dǎo)入不同的植物并可以通過植物種子進(jìn)行遺傳，因此植物內(nèi)生菌具有作為生物農(nóng)藥開發(fā)的優(yōu)良特性。目前柑橘內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌的研究，而內(nèi)生放線菌還很少有人研究，由于從內(nèi)生放線菌中篩選抗生素具有重大意義，因此柑橘內(nèi)生放線菌應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)研究，以篩選具有潛在價(jià)值的菌株應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

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