張?zhí)N慧

（山東省中醫(yī)藥大學(xué)國家高血壓中醫(yī)臨床研究基地國中局中醫(yī)心病學(xué)重點(diǎn)?？疲綎|濟(jì)南250014）

高血壓的研究機(jī)理頗多，鮮有與微血管相關(guān)聯(lián)，然而微血管數(shù)目、質(zhì)量降低導(dǎo)致的缺血性腦卒中、冠心病又嚴(yán)重影響著高血壓的預(yù)后，因此，高血壓微血管研究可能對預(yù)防心、腦、腎等靶器官損害起到積極作用。本研究將MVD及ESM1引入到高血壓研究中，通過微血管數(shù)目及血管生成因子的影響，來探討中藥預(yù)防高血壓及靶器官損害的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供可引證的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物4周齡自發(fā)性高血壓大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～240 g，由中國醫(yī)科院阜外心血管醫(yī)院提供，醫(yī)動字第01-108號。4周齡Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量210～250 g，由山東醫(yī)科大學(xué)動物室提供，動物合格證號：SCXK（魯）20090001。

1.2 藥物桑仙降壓顆粒，組方：桑寄生、淫羊藿、丹參、川芎等，由山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室按正交試驗法優(yōu)選工藝制成，每克含生藥6 g，臨用前加蒸餾水稀釋成含生藥0.8 g/mL的藥液。吲噠帕胺片2.5 mg/粒，由天津力生制藥股份有限公司提供，實(shí)驗前加0.9%氯化鈉注射液適量，制備成濃度0.025 mg/mL的混懸液，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫褂们罢袷?，充分搖勻。

1.3 試劑生物素化山羊抗兔CD34抗體、生物素化山羊抗兔IgG，鏈霉親和素2生物素（SABC）和DAB顯色劑，均由武漢博士德生物工程有限公司提供；Anti-ESM1，為美國santacruz公司產(chǎn)品。

1.4 儀器METTLERAE20型電子分析天平，海特勒托利多（上海）儀器有限公司提供；康樂電熱恒溫水浴槽，上海醫(yī)療器件七廠提供；光學(xué)顯微鏡，由山東省中醫(yī)院病理科提供。

1.5分組與給藥以A標(biāo)示正常對照組即wistar大鼠組；B、C、D分別標(biāo)示自發(fā)性高血壓大鼠不同的給藥方式。B：自發(fā)性高血壓大鼠給予蒸餾水為空白對照組。C：自發(fā)性高血壓大鼠給予吲噠帕胺為西藥對照組。D：自發(fā)性高血壓大鼠給予桑仙降壓顆粒為試驗組。觀測時相點(diǎn)：0組的觀測時間為wistar大鼠、自發(fā)性高血壓大鼠4周齡。1、2的觀測時間為wistar大鼠、自發(fā)性高血壓大鼠給藥后4周、8周。在3個觀測時間點(diǎn)分別觀測，分組為A0、B0；A1、B1、C1、D1；A2、B2、C2、D2，隨機(jī)分組方法 ，每組6只。

1.6 標(biāo)本采集用戊巴比妥鈉（40mg/kg體質(zhì)量）腹腔注射麻醉后，立即經(jīng)腹主動脈注入4℃0.9%氯化鈉注射液，切開下腔靜脈放血，待沖洗液干凈無色后，立即開胸，快速分離、摘取心臟，置入4℃0.9%氯化鈉注射液中快速沖洗3次，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片。

1.7 CD34標(biāo)記MVD采用免疫組化SP法。結(jié)果 判斷：參照AXIOTIS等［2］的標(biāo)準(zhǔn)，由兩位病理醫(yī)生采用盲法（獨(dú)立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個不重復(fù)的視野（不足10個視野的，按實(shí)際觀察到的視野計數(shù)），共紀(jì)錄1000個細(xì)胞，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定。（1）按切片中細(xì)胞著色深淺評分：0分為細(xì)胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。（2）按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評分：1分為＜25%；2分為≥25%且≤50%；3分為＞50%且≤75%；4分為＞75%。取（1）、（2）兩項評分的乘積作為總積分：0～3分為（-）；＞3分且≤6分為（+）；＞6分且≤9分為（++）；＞9分（+++）。（-/+）為低表達(dá)，（++/+++）為高表達(dá)。

1.8 ESM1蛋白含量檢測由兩位病理醫(yī)生采用盲法（獨(dú)立檢測）在高倍鏡（×400）下讀片。每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個不重復(fù)的視野（不足10個視野的，按實(shí)際觀察到的視野計數(shù)），共紀(jì)錄1000個細(xì)胞，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定。結(jié)果 判定同CD34。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CD34表達(dá)比較見表1、圖1。實(shí)驗前，與正常對照組相比，空白對照組心肌CD34表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗4周，自發(fā)性高血壓大鼠各組CD34表達(dá)減少，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，試驗組、西藥對照組CD34表達(dá)均有增多趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗8周，與空白對照組比較，試驗組與西藥對照組CD34表達(dá)均明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 ESM1蛋白含量檢測結(jié)果 比較見表2，圖2。實(shí)驗前，空白對照組大鼠ESM1蛋白光密度值與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗4周，空白對照組大鼠ESM1蛋白光密度值降低，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與空白對照組比較，西藥對照組與試驗組ESM1蛋白光密度值均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗8周，空白對照組大鼠ESM1蛋白光密度值明顯降低，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與空白對照組比較，西藥對照組與試驗組ESM1蛋白光密度值均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。兩組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組CD34表達(dá)積分比較（±s）

表1 各組CD34表達(dá)積分比較（±s）

與同觀測點(diǎn)正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同觀測點(diǎn)空白對照組比較，△P＜0.01。下同。

實(shí)驗前實(shí)驗4周后9.56±0.689.43±0.71空白對照組實(shí)驗8周后正常對照組9.49±0.54組別n66 7.28±0.47*7.08±0.31*西藥對照組67.20±0.35*6.67±0.49*△試驗組67.15±0.40*6.43±0.77*△3.32±0.64**

圖1 各組CD34表達(dá)免疫組化染色（×400）

表2 各組大鼠ESM1蛋白光密度值表達(dá)積分比較（±s）

表2 各組大鼠ESM1蛋白光密度值表達(dá)積分比較（±s）

實(shí)驗前實(shí)驗4周后7.50±0.497.88±0.89空白對照組實(shí)驗8周后正常對照組8.03±0.45組別n66 7.04±0.56*5.78±1.45**西藥對照組66.02±1.717.54±0.98△試驗組66.43±0.697.79±1.21△△4.56±0.79**

圖2 各組ESM1蛋白表達(dá)免疫組化染色（×400）

3 討論

在本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠在4周齡時，出現(xiàn)微血管數(shù)目明顯減少，并隨病程增加出現(xiàn)遞減趨勢，且高血壓伴其他危險因素、靶器官損害或臨床疾病，在降壓的同時，需要治療所有可逆性危險因素、靶器官損害以及各種并存的臨床疾?。?］。因此，在降壓的同時能夠保護(hù)微血管損害應(yīng)成為防止高血壓引發(fā)心肌損害的重要措施之一。

微血管計數(shù)可根據(jù)血管內(nèi)皮標(biāo)記物來判定，在血管內(nèi)皮標(biāo)記物如Ⅷ因子相關(guān)抗原如CD31和CD34抗原中，以CD34抗原特異性最高，CD34被認(rèn)為是最敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)記物，因此CD34免疫組化染色可測量組織微血管密度和面積［5］，作為評價微血管密度的指標(biāo)之一。實(shí)驗結(jié)果 顯示：實(shí)驗前，與正常對照組相比，空白對照組心肌CD34表達(dá)明顯減少；實(shí)驗4周、8周后與正常對照組相比，隨周齡增加空白對照組CD34蛋白表達(dá)逐漸增加，使用桑仙降壓顆粒劑、吲噠帕胺干預(yù)后，CD34蛋白含量較空白對照組明顯減少，表明4周齡SHR已存在微血管密度減少。在研究中筆者發(fā)現(xiàn)，桑仙降壓顆粒組在實(shí)驗4周時對微血管有保護(hù)趨勢，桑仙降壓顆粒、吲噠帕胺用藥8周可減輕SHR的微血管損害，但二者作用無統(tǒng)計學(xué)差異。

對微血管的保護(hù)依賴于血管生成因子，實(shí)驗所選擇的另一個指標(biāo)是ESM1。血管內(nèi)皮細(xì)胞在靜止?fàn)顟B(tài)下，僅有短暫的、嚴(yán)密調(diào)控的血管生成，在正常成人組織，一些抑制血管生成的因子占優(yōu)勢，在缺氧、藥物等因素的刺激下，促進(jìn)血管生成的因子如VEGF等可大量釋放，使內(nèi)皮細(xì)胞活化，形成新的血管，而ESM1因子正是與VEGF呈正相關(guān)的因子，因此本實(shí)驗選擇ESM1作為微血管生成的促進(jìn)因子進(jìn)行觀測。結(jié)果 顯示，實(shí)驗前空白對照組ESM1蛋白光密度值降低；而實(shí)驗4周、8周后ESM1蛋白光密度值的含量呈逐漸減少趨勢，使用桑仙降壓顆研究粒劑、吲噠帕胺干預(yù)后，ESM1蛋白光密度值的含量較空白對照組明顯增多，說明4周齡自發(fā)性高血壓大鼠心肌已有ESM1減少，桑仙降壓顆粒、吲噠帕胺用藥4周、8周均可促進(jìn)ESM1的表達(dá)。

本實(shí)驗結(jié)果 提示，桑仙降壓顆粒劑具有保護(hù)微血管作用，其機(jī)理可能與增強(qiáng)ESM1蛋白密度值的表達(dá)有關(guān)。降壓療效確切的桑仙降壓顆粒［6］可很好地保護(hù)微血管，是否還可通過影響其他血管生成或抑制因子進(jìn)而減輕靶器微血管損害，尚待進(jìn)一步研究。

［1］ Abraham JA，Mergia A，Whang L，et al.Nucleotide se2quence of a bovineclone encoding the angiogenic Protein，ba2sic fibroblast growth factor［J］.Science，1986，233：545.

［2］ 2010年中國高血壓防治指南［J］.中華心血管病雜志，2011，39（7）：579-615.

［3］ Struijker Boudier.Arteriolar and capillary rem odelling in hypertension［J］.Drugs，1999，59 Spec No37.

［4］ 何作云，祝善俊.冠心病的微血管損傷研究進(jìn)展［J］.中國循環(huán)雜志，2003，18（5）：R541.4.

［5］ 朱惠斌，陳懿，譚琥，等.腦泰方提取物對局灶性腦缺血大鼠CD34表達(dá)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（2）：141-144.

［6］ 張?zhí)N慧.桑仙降壓顆粒對自發(fā)性高血壓大鼠平滑肌細(xì)胞Ki-67、bFGF的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2004，2（5）：274-275.