王海灝 仰霈雯 雷家慧 (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所教育部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430030)

越來越多的研究表明，在人體內(nèi)存在著一群具有免疫抑制功能的細(xì)胞，這些細(xì)胞在誘導(dǎo)移植免疫耐受、控制自身免疫性疾病和腫瘤免疫等方面發(fā)揮著重要的作用。因?yàn)檫@種特殊的細(xì)胞可以對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以顧名思義被稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)［1-3］。目前已知，人 Treg 被區(qū)分為兩大類：即自然性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural Treg，nTreg)和誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(induced Treg，iTreg)。有研究表明，nTreg在胸腺中產(chǎn)生，而iTreg則是在外周血或外周淋巴組織中，由原始T細(xì)胞(na ve T cells)受到自體或異體的抗原刺激而產(chǎn)生［4］。雖然，人nTreg和iTreg都具有免疫抑制功能，但iTreg在誘導(dǎo)移植物免疫耐受中的作用更重要。

1995 年，Sakaguchi等［5］率先報(bào)道了 CD4+CD25+T細(xì)胞具有免疫抑制功能;然而，隨著研究的深入，人和鼠的體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)活化的T細(xì)胞也表達(dá)CD25;進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，只有高表達(dá) CD25(CD25high)的CD4+T細(xì)胞才能在體外發(fā)揮免疫抑制功能［6-8］。2003年，Sakaguchi研究組發(fā)現(xiàn)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead transcription factor，F(xiàn)oxP3)與Treg的發(fā)育及功能密切相關(guān)［9］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示FoxP3僅表達(dá)于Treg，而不表達(dá)于未激活的CD4+CD25-T 細(xì)胞或 Th1、Th2 等細(xì)胞中［9，10］，因此，直到現(xiàn)在CD4+CD25+FoxP3+都被公認(rèn)為最具代表性的Treg的細(xì)胞表型。近年來，另一個(gè)人Treg的細(xì)胞標(biāo)志物CD127-逐漸被人們所熟悉，IL-7受體CD127表達(dá)在細(xì)胞表面，并且與FoxP3呈明顯的負(fù)相關(guān)，Treg 不表達(dá)或弱表達(dá) CD127［11］。

雖然iTreg的作用有細(xì)胞與細(xì)胞間接觸和分泌細(xì)胞因子兩種途徑，但是無論在體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都表明，分泌細(xì)胞因子的途徑是起主要作用的［12，13］。因此，除了上述的這些特異性細(xì)胞標(biāo)志物外，一些非特異性的細(xì)胞因子也因?yàn)榕ciTreg的功能相關(guān)而被用于 iTreg的細(xì)胞表型中，如 IL-2-、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+等。

然而，在靜態(tài)條件下，T細(xì)胞并不或僅少量分泌產(chǎn)生細(xì)胞因子，為了研究細(xì)胞因子的變化，必須首先激活淋巴細(xì)胞。目前常用的淋巴細(xì)胞刺激劑為PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate，豆蔻酰佛波醇乙酯)和Ionomycin(離子霉素)，二者聯(lián)合使用被視為淋巴細(xì)胞最經(jīng)典的多克隆刺激劑。然而，PMA/Ionomycin的刺激有一個(gè)無法回避的缺陷，即會(huì)顯著抑制CD4的表達(dá)，這一特點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象為CD4+T細(xì)胞的相關(guān)研究(如研究iTreg)將產(chǎn)生不利影響。近年來，其他的淋巴細(xì)胞刺激劑也陸續(xù)出現(xiàn)在相關(guān)報(bào)道中，如PHA(Phytohaemagglutinin，植物血凝素)等。本研究分別使用PMA/Ionomycin和PHA對(duì)人淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測iTreg的誘導(dǎo)和細(xì)胞表型變化，分析其多樣性。本實(shí)驗(yàn)在體外分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)后進(jìn)行多克隆刺激，誘導(dǎo)產(chǎn)生iTreg，以四色流式細(xì)胞儀檢測其表達(dá)特異性/非特異性細(xì)胞標(biāo)志物和相關(guān)細(xì)胞表型的變化。

1 材料與方法

1.1健康受試者 本實(shí)驗(yàn)中每組實(shí)驗(yàn)均選取5名健康受試者。本實(shí)驗(yàn)實(shí)施前已經(jīng)獲得本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循《赫爾辛基宣言》的精神。所有健康受試者均被詳細(xì)告知本實(shí)驗(yàn)的過程和目的，并簽署知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)依不同的實(shí)驗(yàn)方法分為4組：①空白對(duì)照組：分離出PBMC后馬上染色檢測;②非刺激對(duì)照組：PBMC與細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640(購自Invitrogen Gibco公司)培養(yǎng)16小時(shí)后檢測;③PMA/Ionomycin刺激組：將 PBMC與含 PMA/Ionomycin(購自Sigma公司)的培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時(shí)后檢測;④PHA刺激組：將PBMC與含PHA(購自Remel公司)的培養(yǎng)液培養(yǎng)16小時(shí)后檢測。

1.3細(xì)胞制備、培養(yǎng) 用Ficoll梯度離心法從外周血(50 ml)中提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。用含10%胎牛血清(FCS-500)的RPMI1640將試管中PBMC的濃度調(diào)整為1×106ml-1。空白對(duì)照組的PBMC馬上染色并上機(jī)檢測，其余各組則以1∶1的比例，將PBMC與10%RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(非刺激對(duì)照組)、含 PMA(10 ng/ml)/Ionomycin(1 μg/ml)的培養(yǎng)液(PMA/Ionomycin刺激組)或含PHA(180 μg/ml)的培養(yǎng)液(PHA刺激組)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)。

1.4流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測前準(zhǔn)備 將培養(yǎng)后的PBMC從培養(yǎng)箱中取出，依分組移入準(zhǔn)備好的試管，1 300 r/min離心8分鐘，棄上清。以10 μl PerCP-mouse-IgG1、20 μl FITC-mouse-IgG1、20 μl APC-mouse-IgG1以及 20 μl PE-rat-IgG1(均購自 BD公司)作為Isotype control;依實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，在試管中加入細(xì)胞表面抗體 CD4(PerCP，20 μl，BD)、CD25(APC，5 μl，BD)、CD127(FITC，5 μl，BD)，振蕩后室溫下避光培養(yǎng)15分鐘，加入2 ml緩沖液(DPBS，購自Invitrogen Gibco公司)，洗細(xì)胞(1 300 r/min轉(zhuǎn)速離心 8分鐘，棄上清)。加入 500 μl Perm2溶液(BD公司)作細(xì)胞透膜處理，振蕩后室溫下避光培養(yǎng)10分鐘。再加入2 ml DPBS洗細(xì)胞。加入胞內(nèi)抗體 FoxP3(PE，20 μl，BD)、FoxP3(FITC，5 μl，eBioscience)、IFN-γ (FITC，10 μl，BD)、IL-2(FITC，10 μl，BD)、IL-10(PE，10 μl，BD)、TGF-β(PE，20 μl，R＆D)。振蕩后室溫下避光培養(yǎng)30分鐘，加入2 ml DPBS洗細(xì)胞;再加入2 ml DPBS，繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，洗細(xì)胞。以四色流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry，Calibur，BD公司)檢測。

1.5流式檢測的設(shè)門策略 每支試管有至少100 000信號(hào)被記錄和分析。首先根據(jù)前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)設(shè)門選擇淋巴細(xì)胞群，然后再根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行再次設(shè)門，如選擇CD4+CD25+PBL等。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s的形式表達(dá)，用 PASW Statisticc 18.0(IBM，Chicago，Illinois，USA)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.01為有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1PHA不抑制T細(xì)胞CD4的表達(dá) 圖1所示可見本實(shí)驗(yàn)的設(shè)門策略。與非刺激組相比，PMA/Ionomycin刺激16小時(shí)后，CD4的表達(dá)明顯下降;同時(shí)，PHA刺激后，CD4的表達(dá)并不明顯減少。有意思的是，從圖1中還可以發(fā)現(xiàn)，PMA/Ionomycin和PHA的多克隆刺激后，CD3的表達(dá)均略有下降。可見，PMA/Ionomycin的刺激可以顯著抑制T細(xì)胞CD4分子的表達(dá)，而PHA并不抑制其表達(dá)。

2.2兩種多克隆刺激均可明顯誘導(dǎo)產(chǎn)生大量CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg 圖2所示，在從全血分離得到PBMC(空白對(duì)照組)中，CD4+CD25+FoxP3+CD127-占全部CD4+T細(xì)胞的比例僅為2.0% ±2.6%，即為nTreg的含量。在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)16小時(shí)后，這一比例未見明顯變化(P=n.s.);用PMA/Ionomycin刺激 16小時(shí)后，CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg的表達(dá)升為26% ±19%(P＜0.01)，而用PHA刺激16小時(shí)后則上升為49% ±8.3%(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)液并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg，而不論是PMA/Ionomycin還是PHA，均可以顯著誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+CD127-iTreg。

圖1 設(shè)門策略及CD3和CD4分子在多克隆刺激下的表達(dá)Fig．1 Gating strategy and expressions of CD3 and CD4 during polyclonal stimulation

圖2 CD4+CD25+FoxP3+CD127－PBL在兩種多克隆刺激條件下的表達(dá)Fig．2 Expression of CD4+CD25+FoxP3+CD127－ PBL during polyclonal stimulation

2.3多克隆刺激對(duì) IL-2-、IL-10+和 TGF-β+Treg的影響 多克隆刺激后CD4+CD25+FoxP3+IL-2-、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+和CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達(dá)上升，且 PHA對(duì) IL-2-和TGF-β+iTreg的誘導(dǎo)比PMA/Ionomycin強(qiáng)。細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)后，可以觀察到，在非刺激對(duì)照組中，CD4+CD25+FoxP3+IL-2-、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+和 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達(dá)與空白對(duì)照組中沒有明顯變化(16 h vs 0 h：P=n.s.，見表1～3)，而經(jīng)過PMA/Ionomycin或PHA刺激16小時(shí)后，上述iTreg的表達(dá)明顯上升(均P＜0.01)，提示表達(dá) IL-2-、IL-10+或 TGF-β+的 CD4+CD25+FoxP3+iTreg經(jīng)多克隆刺激后可以明顯被誘導(dǎo)產(chǎn)生，卻不能被細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)。有意思的是，PHA刺激后CD4+CD25+FoxP3+IL-2-的比例較之PMA/Ionomycin刺激后有明顯的差異(42% vs 27%，P＜0.01，表1)，同樣的情況也可以在CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達(dá)上觀察到(33%vs 19%，P＜0.01，表2)，但 PHA 和 PMA/Ionomycin對(duì)CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg的刺激卻并沒有顯著的差異(26%vs 19%，P=n.s.，表3)，提示PMA/Ionomycin和 PHA雖然都可以產(chǎn)生 CD4+CD25+FoxP3+iTreg，但刺激的強(qiáng)度并不相同。

2.4PMA/Ionomycin可誘導(dǎo)CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+的表達(dá)升高 表4的結(jié)果顯示，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+在nTreg中比例極低，接近于零;經(jīng)過16小時(shí)的刺激后，僅PMA/Ionomycin可以成功的誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg(vs非刺激對(duì)照組：P＜0.01)，而PHA卻不行(vs非刺激對(duì)照組：P=n.s.，表4)，提示 PMA/Ionomycin和 PHA 的刺激途徑是不同的。

2.5PMA/Ionomycin刺激后，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的表達(dá)與CD25的水平呈負(fù)相關(guān) 在空白對(duì)照組和非刺激對(duì)照組中，無論CD25的表達(dá)高或低，都幾乎沒有 CD4+細(xì)胞表達(dá) FoxP3+IFN-γ+;而經(jīng)過 PMA/Ionomycin刺激16小時(shí)后，CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL的表達(dá)明顯上升(均P＜0.01)。有意思的是，將用PMA/Ionomycin刺激16小時(shí)后的PBMC根據(jù)CD25的表達(dá)水平來設(shè)門后發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+的 表 達(dá) 高 于 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和 CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+的表達(dá)，即誘導(dǎo)產(chǎn)生的 CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL的表達(dá)與 CD25呈逆相關(guān)(圖3)，且 CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+的 表 達(dá) 水 平 與 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+、CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+相比均有顯著性差異(13% ±3.7% vs 3.4% ±2.4%，13% ±3.7%vs 1.4% ±2.0%，均P＜0.01)，但是 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=n.s.)，這個(gè)結(jié)果表明，在多克隆刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL中，真正具有免疫抑制功能的CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+iTreg只是很少一部分，這也反映了iTreg的多樣性變化。

表1 CD4+CD25+FoxP3+IL-2－iTreg的表達(dá)Tab．1 Expression of CD4+CD25+FoxP3+IL-2－ iTreg

表2 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg的表達(dá)Tab．2 Expression of CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg

表3 CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg的表達(dá)Tab．3 Expression of CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg

表4 各組CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg占全部CD4+PBL的百分比Tab．4 Proportion of CD4+PBL expressing CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg

圖3 CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL與CD25的表達(dá)的關(guān)系Fig．3 Relationship between expression of CD4+FoxP3+IFN-γ+PBL and CD25

3 討論

Treg(尤其是iTreg)的細(xì)胞表型多樣性研究一直是Treg相關(guān)研究的熱點(diǎn)。在各種文獻(xiàn)報(bào)道中，多種細(xì)胞標(biāo)志物被用于表示iTreg的細(xì)胞表型，造成在對(duì)iTreg進(jìn)行比較和研究時(shí)常常產(chǎn)生誤會(huì)。

本實(shí)驗(yàn)，既關(guān)注于iTreg的特異性細(xì)胞標(biāo)志物(CD25+、FoxP3+、CD127-)，又關(guān)注于非特異性細(xì)胞標(biāo)志物(IL-2-、IL-10+、TGF-β+、IFN-γ+)，通過在體外實(shí)驗(yàn)中多克隆刺激的方式，誘導(dǎo)產(chǎn)生不同細(xì)胞表型的iTreg，研究其刺激前后的變化。實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于全血進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離后馬上檢測的新鮮細(xì)胞(Fresh cells)的結(jié)果，可以反映血液中nTreg的狀況。通過實(shí)驗(yàn)中可以看出，外周血中細(xì)胞表型為CD4+CD25+FoxP3+CD127-的 nTreg約占全部CD4+T細(xì)胞的4%左右，這部分nTreg細(xì)胞在維持自身的免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。而非特異性細(xì)胞標(biāo)志物在nTreg中的表達(dá)同樣非常低，這是因?yàn)樵陟o止?fàn)顟B(tài)下，機(jī)體不分泌或僅分泌少量的細(xì)胞因子。只有在細(xì)胞活化的時(shí)候，細(xì)胞內(nèi)合成細(xì)胞因子才會(huì)增加。要研究細(xì)胞因子的變化，必須使用淋巴細(xì)胞刺激劑使之活化。

目前最常用的淋巴細(xì)胞刺激劑是PMA/Ionomycin和PHA兩種。本實(shí)驗(yàn)研究和比較了兩種激活劑對(duì)iTreg的刺激效果，為選擇合適的實(shí)驗(yàn)劑量，在課題預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們比較了 PMA(5、10、20 ng/ml)/Ionomycin(0.5、1、2 μg/ml) 和 PHA(90、180、270 μg/ml)等多個(gè)劑量對(duì) T 細(xì)胞 CD4、CD8、CD25、IL-10、TGF-β、IFN-γ的刺激效果，各濃度間無明顯差異(P=n.s.，具體數(shù)據(jù)未顯示)，均可視為對(duì)淋巴細(xì)胞充分刺激。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PMA/Ionomycin和PHA均可以有效的刺激靜止的淋巴細(xì)胞活化，并誘導(dǎo)產(chǎn)生iTreg。值得注意的是，這二者刺激的效果并不一樣，對(duì)表達(dá) IFN-γ的 Treg誘導(dǎo)過程中可以發(fā)現(xiàn)，PMA/Ionomycin可以有效的刺激產(chǎn)生CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg，而PHA則不能誘導(dǎo)產(chǎn)生;而對(duì)于表達(dá)IL-2-和TGF-β+的Treg的誘導(dǎo)過程中可以看到，PMA/Ionomycin和PHA對(duì)iTreg的刺激力度是不一樣的，提示PMA/Ionomycin和PHA對(duì)淋巴細(xì)胞的刺激有不同的作用途徑。另外，以PMA/Ionomycin作為激活劑對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激會(huì)顯著降低CD4分子的表達(dá)(本實(shí)驗(yàn)中，刺激前54%的CD3+T細(xì)胞表達(dá)CD4+，而刺激后僅16%，具體數(shù)據(jù)未顯示)，這嚴(yán)重影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以CD4+細(xì)胞設(shè)門分析iTreg的表達(dá)。因此，有報(bào)道指出，可以用CD3+CD8-T細(xì)胞設(shè)門來代替 CD3+CD4+T 細(xì)胞［14］;但是，我們?cè)谝苑荂D4組合抗體(Cocktail sets)和CD8抗體進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，PMA/Ionomycin刺激后的淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3+CD4-的細(xì)胞并非全部表達(dá)CD3+CD8+(具體數(shù)據(jù)未顯示)，即CD3+CD8-T細(xì)胞也并不能代替CD3+CD4+T細(xì)胞，它還包括有自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和部分CD3+CD8-CD4-細(xì)胞。有意思的是，雖然PMA/Ionomycin刺激后會(huì)降低CD4+的表達(dá)，但是刺激后CD4+iTreg的表達(dá)卻明顯升高，各種特異性和非特異性的細(xì)胞標(biāo)志物均明顯升高。同時(shí)，對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所觀測幾項(xiàng)指標(biāo)，除了CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg外，其余的細(xì)胞標(biāo)志物在受到PHA的刺激后升高的程度比PMA/Ionomycin更高，這為進(jìn)一步的分選擇iTreg或功能實(shí)驗(yàn)提供了一種新的選擇。另外，經(jīng)過PMA/Ionomycin或PHA刺激后，流式細(xì)胞檢測時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)PBMC與刺激前出現(xiàn)了明顯的變化，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞群與單核細(xì)胞群出現(xiàn)明顯的重疊，并由于染色過程中破膜，使得細(xì)胞變小、顆粒減少，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上表現(xiàn)為細(xì)胞群向左下移動(dòng)、聚集，而不易圈出明顯的淋巴細(xì)胞群。

在所有細(xì)胞因子中，分泌IL-10、TGF-β及缺乏IL-2一直被公認(rèn)為是與iTreg的發(fā)育和功能密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)也觀測到 CD4+CD25+FoxP3+IL-2-iTreg、CD4+CD25+FoxP3+IL-10+iTreg 和 CD4+CD25+FoxP3+TGF-β+iTreg在受到刺激后表達(dá)明顯升高。IFN-γ是一類比較特殊的細(xì)胞因子。雖然幾乎所有的淋巴細(xì)胞都可以產(chǎn)生IFN-α和IFN-β，但是只是活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞才能產(chǎn)生IFN-γ。以前，IFN-γ被認(rèn)為是Th1細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，但是后來又發(fā)現(xiàn)Treg和CD8+T細(xì)胞同樣可以產(chǎn)生IFN-γ，且IFN-γ在抗炎癥、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。

近來，德國Daniel研究組(筆者作為主要研究者參與其中)陸續(xù)報(bào)道，表達(dá)IFN-γ的CD4+iTreg和腎移植術(shù)后患者移植腎功能長期存活密切相關(guān)。在對(duì)腎移植術(shù)后患者的長期隨訪監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，與移植腎功能受損的患者相比，移植物功能良好的患者體內(nèi)表達(dá) IFN-γ的 CD4+Treg(CD3+CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+)數(shù)量明顯升高，提示 IFN-γ 也許在誘導(dǎo)人移植物免疫耐受中發(fā)揮著重要的作用，并認(rèn)為CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的免疫抑制功能可能是IFN-γ依賴性的［15-17］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，雖然PMA/Ionomycin刺激后，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg的表達(dá)會(huì)明顯升高，但是其表達(dá)水平與CD25的水平呈逆相關(guān)，雖然 CD4+CD25intermediateFoxP3+IFN-γ+和 CD4+CD25highFoxP3+IFN-γ+的水平無明顯差異，但是隨著CD25水平的升高，CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg占所有CD4+T細(xì)胞的百分比越低，這也許表明真正具有免疫抑制功能的CD4+CD25+FoxP3+IFN-γ+iTreg在外周血中含量極低。值得探討的是，雖然也有文獻(xiàn)報(bào)道刺激后的CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)FoxP3+，且同樣會(huì)產(chǎn)生活化的細(xì)胞因子［18］，但本實(shí)驗(yàn)中觀察到的部分細(xì)胞刺激后表達(dá)為 CD4+CD25-FoxP3+IFN-γ+，是否全部為誘導(dǎo)性的CD4+CD25-T細(xì)胞，是否包括部分的自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)，這些都值得進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過使用PMA/Ionomycin和PHA對(duì)人PBMC進(jìn)行多克隆刺激后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生iTreg。不同細(xì)胞表型的iTreg反映了人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的多樣性變化，同時(shí)細(xì)胞表型中表達(dá)或不表達(dá)的細(xì)胞因子與iTreg的作用機(jī)制可能密切相關(guān);實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)現(xiàn)PMA/Ionomycin和PHA對(duì)人iTreg誘導(dǎo)的機(jī)制和程度不一樣。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有利于進(jìn)一步開展人iTreg的功能實(shí)驗(yàn)，并最終將人iTreg的實(shí)驗(yàn)成果應(yīng)用于臨床的診斷和治療實(shí)踐中。

1 Sakaguchi S，Wing K，Onishi Y et al．Regulatory T cells：how do they suppress immune responses? ［J］.Int Immunol，2009;21：1105-1111.

2 Nomura T，Sakaguchi S.Naturally arising CD25+CD4+regulatory T cells in tumor immunity［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2005;293：287-302.

3 Sakaguchi S.Regulatory T cells：key controllers of immunologic selftolerance［J］.Cell，2000;101：455-458.

4 Bluestone J A，Abbas A K.Natural versus adaptive regulatory T cells［J］.Nat Rev Immunol，2003;3：253-257.

5 Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M et al．Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alphachains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol，1995;155：1151-1164.

6 Takahashi T，Kuniyasu Y，Toda M et al．Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+naturally anergic and suppressive T cells：induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state［J］.Int Immunol，1998;10：1969-1980.

7 Baecher-Allan C，Brown J A，F(xiàn)reeman G J et al．CD4+CD25highregulatory cells in human peripheral blood［J］.J Immunol，2001;167：1245-1253.

8 Wang Z，F(xiàn)u X Y，Shi B Y et al．Antigen-specific suppression by induced CD4+CD25highregulatory T cells in kidney recipients［J］.Transplant Proc，2009;41：1574-1576.

9 Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003;299：1057-1061.

10 Fontenot J D，Gavin M A，Rudensky A Y.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells［J］.Nat Immunol，2003;4：330-336.

11 Liu W，Putnam A L，Xu-Yu Z et al．CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+T reg cells［J］.J Exp Med，2006;203：1701-1711.

12 Thornton A M，Donovan E E，Piccirillo C A et al．Cutting edge：IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4+CD25+T cell suppressor function［J］.J Immunol，2004;172：6519-6523.

13 Sanchez-Lockhart M，Marin E，Graf B et al．Cutting edge：CD28-mediated transcriptional and posttranscriptional regulation of IL-2 expression are controlled through different signaling pathways［J］.J Immunol，2004;173：7120-7124.

14 Rostaing L，Tkaczuk J，Durand M et al．Kinetics of intracytoplasmic Th1 and Th2 cytokine production assessed by flow cytometry following in vitro activation of peripheral blood mononuclear cells［J］.Cytometry，1999;35：318-328.

15 Daniel V，Naujokat C，Sadeghi M et al．Observational support for an immunoregulatory role of CD3+CD4+CD25+IFN-gamma+blood lymphocytes in kidney transplant recipients with good long-term graft outcome［J］.Transpl Int，2008;21：646-660.

16 Volker Daniel，Mahmond Sadeghi，Haihao Wang et al．CD4(+)CD25(+)Foxp3(+)IFN-γ(+)human induced T regulatory cells are induced by interferon-γ and suppress alloresponses nonspecifically［J］.Hum Immunol，2011;72：699-707.

17 Volker Daniel，Mahmond Sadeghi，Haihao Wang et al．CD4+CD25+Foxp3+IFN-g+induced human Treg are a heterogenous cell population suppressing alloresponses specifically as well as unspecifically［J］.Transpl Int，2011;24(Suppl 2)：114-119.

18 Naqar M，Vernitsky H，Cohen Y et al．Epigenetic inheritance of DAN methylation limits activation-induced expression of FOXP3 in conventional human CD25-CD4+T cells［J］.Int Immunol，2008;20(8)：1040-1055.