王 華 劉 俊 戴東方 管賢偉 丁 杰 邵世和 (江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江212013)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)是人類常見的致病菌之一，是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍等胃部疾患的主要病因，并且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，被WHO列為Ⅰ類致癌原。近年來的統(tǒng)計數(shù)字表明胃癌是全球的第四大腫瘤，而且在由癌癥導(dǎo)致的死亡中位居第二［1］。

已證實，高致病性的H．pylori菌株都含有一長度為40 kb的致病島(Cag-PAI)，編碼CagA(細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白)在內(nèi)的27～31個與毒素及毒素裝配和分泌功能相關(guān)的蛋白。CagA是H．pylori最主要的致病因子［2］，此蛋白是通過致病島編碼的由多個蛋白組成的Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞的［3］，之后在細(xì)胞內(nèi)的特定部位被磷酸化，干擾細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)［4，5］，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生及胃癌的產(chǎn)生［6］。然而，關(guān)于負(fù)責(zé)CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌系統(tǒng)的研究較少，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制也尚未明確。

本研究選擇H．pyloriⅣ型分泌系統(tǒng)中的cagL基因為研究對象，采用同源重組的方法，構(gòu)建cagL基因缺失的自殺質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化H．pylori，通過抗性基因成功地篩選出了目的基因的缺失株，并分析基因缺失前后，CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能的變化，為揭示Ⅳ型分泌系統(tǒng)中cagL基因在CagA轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，以及更深入地認(rèn)識H．pylori的致病機(jī)制與完善Ⅳ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)都極有必要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞 H．pylori NCTC11637由中國疾病控制中心張建中教授饋贈，大腸埃希菌

①本文受鎮(zhèn)江市2008年度第四批科技計劃(社會發(fā)展)項目資助(SH2008031)

②江蘇大學(xué)附屬江濱醫(yī)院，鎮(zhèn)江212000

1.1.2主要試劑及儀器 哥倫比亞培養(yǎng)基、微需氧產(chǎn)氣袋購自O(shè)XOID公司Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶 EcoRI、KpnI、BamHI及 XhoI、T4-DNA連接酶、DL2000 DNA marker及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)購自TaKaRa公司;高糖DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自GibcoBRL公司;小牛血清購自上海華美生物公司;CagA蛋白單克隆抗體、細(xì)胞裂解液RIPA購自 Santa Cruz公司;β-actin內(nèi)參抗體，ECL購自碧云天公司;其他常規(guī)試劑按照分子克隆實驗指南配制。

1.2自殺質(zhì)粒同源臂的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank公布的H．pylori全基因組序列，在cagL基因ORF的上游和下游設(shè)計兩個同源臂F1和F2的引物(如表1)。cagL基因全長739 bp;P1/P2/P3/P4分別為兩同源臂上下游特異性引物，擴(kuò)增后獲得用于構(gòu)建自殺質(zhì)粒的同源臂F1和F2片段。引物由上海英俊生物公司合成。以H．pylori NCTC11637菌株基因組DNA為模板，用ExTap聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增：條件為：94℃ 5分鐘，94℃ 45秒、55℃ 45秒、72℃ 50秒，30個循環(huán)，72℃ 10分鐘;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，GeNius凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定并用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.3自殺質(zhì)粒pBluescript/△cagL：KMr的構(gòu)建 取cagL F1及F2的PCR膠回收產(chǎn)物分別與pMD18-2T用T4-DNA連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布于含50 μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時。挑取菌落轉(zhuǎn)種于終濃度為50 μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖10小時，用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取，并進(jìn)行酶切鑒定。膠回收同源臂片段F1、F2，分兩步將F1、F2與載體pBlueKM40連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E．coli DH5a，轉(zhuǎn)化好的細(xì)菌涂布終濃度為100 μg/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～16小時，挑選單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃搖床振蕩培養(yǎng)10小時，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。

表1 構(gòu)建cagL基因缺失引物列表Tab．1 Primers designed for the deletion of cagL

1.4cagL基因缺失株的構(gòu)建與鑒定 從培養(yǎng)18～24小時的哥倫比亞培養(yǎng)基上刮 H．pylori(1010CFUP/ml)，10%甘油-蔗糖溶液洗滌，4℃ 5 000 r/min離心5分鐘，沉淀重懸于100 μl甘油-蔗糖溶液，4℃放置10分鐘，加自殺質(zhì)粒25 μg，混勻，移入冰預(yù)冷的電擊杯，冰浴5分鐘后置于電穿孔架上，電擊條件：25F，2.5 kV，200 Ω 5 秒，電擊后用 SOC 緩沖液20倍稀釋H．pylori，涂布于25 mg/L卡那霉素的血平板上，37℃微需氧條件，培養(yǎng)72小時，收取細(xì)菌。

收獲細(xì)菌經(jīng)尿素酶以及細(xì)菌染色鑒定后，以野生株NCTC 11637為對照，用擴(kuò)增上游片段F1的上游引物P1和下游片段F2的下游引物P4進(jìn)行菌液PCR鑒定，擴(kuò)增條件為：94℃ 10分鐘，94℃ 50秒、55℃ 50秒、72℃ 2.5分鐘，35個循環(huán)，72℃ 10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英駿生物工程公司測序鑒定無誤后，將突變株命名為ΔhpcagL。

1.5CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)實驗 胃上皮細(xì)胞GES-1常規(guī)培養(yǎng)2～3天后，按照MOI=300∶1比例加入新鮮培養(yǎng)的野生型和缺失株ΔhpcagL;在5%CO2培養(yǎng)條件下作用4小時;PBS洗滌3次后，收集細(xì)胞重懸于Western blot細(xì)胞裂解液中。

取裂解后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，然后4℃電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1小時，換新鮮的封閉液，加入一抗(CagA單克隆抗體)，4℃孵育過夜。1×TBST洗滌3次，每次10分鐘，于1×TBST中加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鼠IgG作為二抗，37℃ 搖床反應(yīng)1小時，最后ECL顯色。同時以β-actin蛋白為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1cagL基因缺失自殺質(zhì)粒的構(gòu)建 將構(gòu)建cagL基因缺失株的自殺質(zhì)粒pBluescript/△cagL：：KMr連接好后，進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示：經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ酶切，電泳圖下方出現(xiàn)約為651 bp片段(F1);經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ 酶切，電泳圖下方出現(xiàn)約666 bp片段(F2);與設(shè)計結(jié)果完全相符(圖1)。

圖1 自殺質(zhì)粒pBluescript/△cagL::KMr的酶切鑒定Fig．1 Identification of pBluescript/△cagL::KMrby restricted endonuclease enzyme

2.2cagL基因缺失株的鑒定 用引物P1和P4對篩選獲得的缺失株進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示，野生型經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了一大小約為2 kb的片段，而cagL基因缺失株，則獲得了一約2.5 kb大小片段，與理論設(shè)計相符(圖2)。測序結(jié)果進(jìn)一步證實cagL基因同源重組的成功。

2.3cagL基因缺失前后對CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響 將野生型和cagL基因缺失株，分別與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng);細(xì)胞裂解后進(jìn)行Western blot分析;結(jié)果表明(圖3)，H．pylori野生型和 cagL基因缺失株，均未能檢測到CagA蛋白，cagL基因缺失能導(dǎo)致CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失。

3 討論

H．pylori在世界上分布廣泛，是慢性活動性胃炎的病原體，其感染是消化性潰瘍、胃癌和胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的重要危險因素［7，8］。來自世界各地的流行病學(xué)研究證實，幽門螺桿菌感染與胃癌有關(guān)，CagA蛋白被認(rèn)為是一種潛在的癌蛋白，在致癌過程中可能發(fā)揮重要作用［9］。該蛋白可借助IV分泌系統(tǒng)直接進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，然而，關(guān)于負(fù)責(zé)CagA 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌系統(tǒng)及其轉(zhuǎn)運(yùn)裝置相關(guān)基因的報道較少。

圖2 cagL基因缺失株的鑒定Fig．2 Identification of cagL deletion mutant

圖3 Western blot法檢測CagA轉(zhuǎn)運(yùn)能力Fig．3 The ability of translocation of CagA via Western blot method

目前，對 CagF/HP0543、CagD/HP0545等基因的功能作了一些初步的研究?；蛉笔а芯勘砻鰿agZ對于CagA轉(zhuǎn)運(yùn)是必須的，但對于IL-8的誘導(dǎo)并不產(chǎn)生顯著的影響，而CagN、CagG、CagF、CagD對CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)與IL-8的誘導(dǎo)都是必須的，可能這幾種蛋白可穩(wěn)定Ⅳ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的功能［10］;尚有報道指出 CagI(HP0540)、CagA的 N端及 CagY(HP0527)的 C端，均與整合素 β1具有相互作用［11］;CagF可以識別CagA蛋白的C端區(qū)域，輔助其轉(zhuǎn)運(yùn)，可能參與CagA蛋白的募集作用［12］;CagD蛋白的折疊方式與SycT這種分子伴侶似，SycT是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白［13］，因此，CagD可能是一個多功能的Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白，不僅與CagA轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，而且也能分泌到細(xì)菌外，促進(jìn)對宿主細(xì)胞的一種附加作用［14］。

本研究利用同源重組原理，構(gòu)建了cagL基因的缺失株，并比較該基因缺失前后對效應(yīng)蛋白CagA轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響。研究選用克隆質(zhì)粒pBluescript SKⅡ(-)來構(gòu)建載體，該載體在多克隆位點處插入一個卡那霉素抗性基因盒，采用PCR方法擴(kuò)增cagL基因編碼區(qū)(ORF)兩側(cè)區(qū)域的基因片段(F1)(651 bp)和(F2)(666 bp)，以二者作為同源重組的同源臂片段。然后采用電穿孔技術(shù)將重組載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入野生株NCTC11637菌體內(nèi)，載體與野生株染色體之間發(fā)生同源重組，使卡那抗性基因置換野生株的cagL基因，因此，cagL基因敲除的突變株pBluescript/△cagL：：KMr得以建立，并用PCR方法鑒定其缺失株，為進(jìn)一步研究cagL基因的功能奠定基礎(chǔ)。最后本文將H．pylori野生型及缺失株，與正常胃上皮細(xì)胞GES-1進(jìn)行共培養(yǎng)后檢測了CagA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，Western blot的結(jié)果顯示cagL基因敲除后，CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失，說明cagL對CagA蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)是必不可少的，是CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中重要組成成分之一，為深入研究cagL基因的功能奠定基礎(chǔ)。

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