屈 靜 張 建 (山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

免疫防御是免疫系統(tǒng)在高等脊椎動(dòng)物進(jìn)化中獲得的能夠識(shí)別“自己”和“非己”、清除外源性和內(nèi)源性抗原成分、保護(hù)自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的專門機(jī)制。其中天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗外界感染和異常病理過(guò)程的第一道防線。天然免疫系統(tǒng)通過(guò)自身的模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別微生物的病原相關(guān)分子模式(PAMP)，啟動(dòng)下游一系列精密而復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)，主要通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、促炎因子和趨化因子，發(fā)揮直接的免疫效應(yīng)或?qū)罄m(xù)的適應(yīng)性免疫發(fā)揮增強(qiáng)和調(diào)節(jié)作用。

PRR包括 Toll樣受體(TLR)、RIG-I樣受體(RLR)和NOD樣受體(NLR)等。其中TLR3作為關(guān)鍵性的雙鏈RNA識(shí)別受體，在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)體膜上均有表達(dá)，可識(shí)別病毒來(lái)源的dsRNA及其類似物 poly(I：C)，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)［1］。越來(lái)越多的研究證實(shí)，PRR不僅表達(dá)在免疫細(xì)胞中，在各種實(shí)質(zhì)細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞中也有廣泛的表達(dá)，且表達(dá)譜各異［2］。考慮到PRR的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)與其他的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路存在密切的“cross-talking”，提示在非免疫細(xì)胞中PRR活化傳遞了不同于內(nèi)源性免疫激活過(guò)程的分子事件。有關(guān)研究表明，這些PRR在腫瘤發(fā)生中的作用可能是把“雙刃劍”，即在不同的腫瘤細(xì)胞和組織中，不同的PRR的激活可以產(chǎn)生完全不同的生物學(xué)效果。有的PRR激動(dòng)劑可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存，有的則明顯抑制腫瘤細(xì)胞存活［3］。因此，靶向PRR的激動(dòng)劑或者拮抗劑就有可能作為潛在的腫瘤生物治療藥物來(lái)控制腫瘤進(jìn)程。

poly(I：C)作為免疫治療佐劑用于腫瘤的生物治療已被廣泛證實(shí)，它可以通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的TLR3或RLR，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，增強(qiáng)抗腫瘤的天然免疫應(yīng)答，改善腫瘤造成的抑制性免疫環(huán)境［4］。然而，胃腺癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞TLR的表達(dá)特征、poly(I：C)對(duì)BGC-823細(xì)胞生物學(xué)特征的影響以及poly(I：C)對(duì)NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗胃癌天然免疫反應(yīng)的直接和間接作用目前仍無(wú)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人胃腺癌細(xì)胞系BGC-823，人NK細(xì)胞系NKL，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試劑 poly(I：C)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;RPMI1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司;胎牛血清購(gòu)于上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;EdU Apollo 567 DNA體外檢測(cè)試劑盒購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用TLR-3抗體購(gòu)于Biolegend公司;總RNA提取Trizol試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于Invitrogen公司;半定量PCR試劑Easy Taq DNA聚合酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;實(shí)時(shí)定量PCR試劑SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)于東洋紡生物科技有限公司;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用CFDA SE(CFSE)細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所;Cyclin D1、7-AAD、CD107a、Perforin 和 TNF-α 抗體購(gòu)于BD Pharmingen公司。

1.1.3引物設(shè)計(jì) 半定量PCR及實(shí)時(shí)定量PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。引物序列如表1所示。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng);NKL細(xì)胞用含10%胎牛血清以及100 U/ml IL-2的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2.2總RNA的提取與RT-PCR檢測(cè) 收集2×105～5×105細(xì)胞于無(wú) RNA酶EP管中，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。用適量DEPC處理水溶解RNA后，檢測(cè)RNA濃度及純度。取2 μg RNA按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR。半定量PCR按照下列體系配制總體積25 μl反應(yīng)液：10×PCR Buffer 2.5 μl;dNTP(10 mmol/L)0.5 μl;cDNA 1 μl;Taq DNA聚合酶 0.25 μl;上下游引物(100 μmol/L)各 1 μl;H2O 18.75 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 1分鐘，1個(gè)循環(huán);95℃ 1分鐘，54～62℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10分鐘。實(shí)時(shí)定量PCR按照下列體系配制總體積20 μl反應(yīng)液：2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μl;上下游引物(5 μmol/L)各 2 μl;cDNA(稀釋 30 倍)6 μl。擴(kuò)增條件：95℃ 1分鐘，1個(gè)循環(huán);95℃ 15秒，60℃ 15秒，72℃45秒，50個(gè)循環(huán);95℃ 1分鐘，1個(gè)循環(huán);60℃ 1分鐘，1個(gè)循環(huán);70～98.5℃ 1秒，58個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后溫度增加0.5℃。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度Tab．1 The primer sequences used for PCR and the length of amplified fragment

1.2.3MTT法細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.8×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15小時(shí)。用不同濃度的poly(I：C)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，總體積為200 μl，分別培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)。終止培養(yǎng)前每孔加入20 μl MTT(終濃度為1 mg/ml)，37℃孵育4小時(shí)。2 500 r/min離心20分鐘，棄上清后加入200 μl DMSO，輕輕吹打使得甲瓚沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 570/630 nm處吸光度值。

1.2.4CCK-8法細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞處理方法同上，終止培養(yǎng)前吸出100 μl培養(yǎng)上清，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育2小時(shí)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 450/630 nm處吸光度值。

1.2.5EdU摻入法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，0.8×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 小時(shí)。加入 50 μg/ml poly(I：C)，總體積為200 μl，培養(yǎng)24小時(shí)后按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6MTT法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將密度調(diào)至5.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，2 ml/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15小時(shí)。加入50 μg/ml poly(I：C)培養(yǎng)24小時(shí)后，消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將密度調(diào)至1 ×105個(gè)細(xì)胞/ml，100 μl/孔接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)使其完全貼壁。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NKL細(xì)胞，按照效靶比5∶1、2.5∶1和1.25∶1，100 μl/孔接入已鋪好靶細(xì)胞的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置靶細(xì)胞對(duì)照組、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組和培養(yǎng)基對(duì)照組。共孵育10小時(shí)后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl(終濃度為 1 mg/ml)，37℃ 孵育 4小時(shí)。2 500 r/min離心25分鐘，棄上清。加入200 μl DMSO，輕輕吹打使得甲瓚沉淀充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 570/630 nm處吸光度值。按照下列公式計(jì)算NKL細(xì)胞殺傷活性：殺傷活性(%)=1-(ODE+TODE)/ODT×100%(ODE+T：實(shí)驗(yàn)孔平均 OD 值;ODE：效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔平均OD值;ODT：靶細(xì)胞對(duì)照孔平均OD值)。

1.2.7CFSE-7-AAD法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BGC-823細(xì)胞，將密度調(diào)至5.0×105個(gè)細(xì)胞/ml，2 ml/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15小時(shí)。加入50 μg/ml poly(I：C)培養(yǎng)24小時(shí)后，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行CFSE標(biāo)記，2.0×105個(gè)細(xì)胞/ml接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12小時(shí)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期NKL細(xì)胞，按照效靶比1∶1接入已鋪好靶細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，共孵育10小時(shí)后，收集細(xì)胞，進(jìn)行7-AAD染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。按照下列公式計(jì)算NKL細(xì)胞殺傷活性：殺傷活性(%)=CFSE+7-AAD+細(xì)胞比例/CFSE+細(xì)胞比例-BGC-823細(xì)胞自然凋亡率。

1.2.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分子表達(dá) 收集細(xì)胞(若對(duì)NK細(xì)胞CD107a及TNF-α進(jìn)行檢測(cè)，則需要提前4小時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度6 μg/ml莫能霉素和10 μg/ml brefeldin A)后，1×PBS洗一遍，1 300 r/min離心5分鐘。棄上清，用200 μl固定液重懸細(xì)胞，4℃避光孵育30分鐘。1×PBS洗一遍，1 300 r/min離心5分鐘。棄上清，用100 μl穿膜液重懸細(xì)胞，4℃避光孵育30分鐘。按照說(shuō)明書指定用量加入抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。4℃避光孵育1小時(shí)。1×PBS洗一遍后，用200 μl 1×PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 兩組數(shù)據(jù)間比較采用成對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BGC-823細(xì)胞TLR受體基礎(chǔ)表達(dá)水平檢測(cè)及其應(yīng)答poly(I：C)后的變化 BGC-823細(xì)胞TLR受體mRNA表達(dá)水平如圖1A所示，除TLR7和TLR8外，其余8種TLR受體均有不同程度的表達(dá)，其中TLR3、TLR4 表達(dá)水平較高。50 μg/ml poly(I：C) 刺激BGC-823細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞膜上TLR3細(xì)胞陽(yáng)性比例由54%升至83%，而胞內(nèi)的TLR3表達(dá)水平無(wú)明顯改變(圖1B)。

2.2poly(I：C)抑制 BGC-823細(xì)胞增殖 MTT方法檢測(cè)證實(shí)，poly(I：C)作用24、48小時(shí)可顯著抑制細(xì)胞活力，且具有濃度依賴性(圖2A)。100 μg/ml poly(I：C)對(duì)細(xì)胞活力的抑制率可達(dá)40%左右。同時(shí)利用 CCK-8方法也得到了類似的結(jié)果(圖2B)。進(jìn)一步利用EdU摻入實(shí)驗(yàn)證實(shí)，poly(I：C)處理后的DNA合成能力明顯下降(圖2C上，放大倍數(shù)為200倍)，圖2C下為三次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果［control組為38.18% ± 2.75%，poly(I：C)組為21.7% ±4.53%］。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)50 μg/ml poly(I：C)處理24小時(shí)后Cyclin D1的表達(dá)水平由88%降至82%(圖2D上)，圖2D下為三次平行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果［control組為88.33% ±2.32%，poly(I：C)為 81.33% ± 3.05%］。

2.3poly(I：C)可改善腫瘤微環(huán)境 如圖3所示，50 μg/ml poly(I：C)處理 12 小時(shí)后，BGC-823 細(xì)胞炎癥因子 TNF-α、IL-8和免疫抑制因子 TGF-β的mRNA表達(dá)水平有顯著性降低，IL-6表達(dá)水平有所升高，圖3為三次平行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。

2.4poly(I：C)可增強(qiáng)BGC-823細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性 圖4A所示，MTT法實(shí)驗(yàn)證實(shí)，用濃度為50 μg/ml poly(I：C)處理 BGC-823 細(xì)胞后，NKL對(duì)于poly(I：C)刺激組BGC-823細(xì)胞的殺傷功能顯著高于未處理組。NK細(xì)胞殺傷率上升幅度在5%～20%之間。利用CFSE-7-AAD染色法得到了類似的結(jié)果。如圖4B左所示，poly(I：C)處理后，被NKL細(xì)胞殺傷的BGC-823細(xì)胞(CFSE+7-AAD+)比例明顯高于未處理組。圖4B右為三次平行實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果［control組為7.71% ±1.18%，poly(I：C)組為17.34% ±1.30%］。與此同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NKL細(xì)胞CD107a、Perforin和 TNF-α的表達(dá)水平，如圖4C上所示，相比未處理組，NKL細(xì)胞表達(dá)CD107a以及Perforin和TNF-α的能力有所增強(qiáng)，圖4C下為三次平行實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。因此，poly(I：C)可以提高BGC-823細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性。

圖1 BGC-823細(xì)胞TLR受體基礎(chǔ)表達(dá)水平檢測(cè)及其應(yīng)答poly(I:C)后的變化Fig．1 Basic expression levels of TLRs on BGC-823 cells and the changes of TLR3 in response to poly(I:C)treatment

圖2 Poly(I:C)抑制BGC-823細(xì)胞增殖Fig．2 Poly(I:C)could suppress the proliferation of BGC-823 cells

圖3 poly(I:C)可改善腫瘤微環(huán)境Fig．3 poly(I:C)improved the tumor microenvironment

圖4 poly(I:C)可增強(qiáng)BGC-823細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷的敏感性Fig．4 poly(I:C)could enhance the sensitivity of BGC-823 cell to NK cell cytolysis

3 討論

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率在惡性腫瘤中居首位［5］。近40年來(lái)，國(guó)內(nèi)外針對(duì)胃癌的基礎(chǔ)研究工作，包括胃癌的生物治療方案的設(shè)計(jì)和實(shí)踐探索從未間斷，并取得了很大的進(jìn)展。然而，胃癌的臨床治療手段還比較有限，而生物治療策略的實(shí)現(xiàn)有賴于對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的基本分子機(jī)制的細(xì)致了解。因此，加強(qiáng)胃癌病因?qū)W基礎(chǔ)和診治手段的研究，特別是從腫瘤免疫學(xué)的角度開(kāi)展設(shè)計(jì)生物治療策略有著十分重要的意義。

poly(I：C)是雙鏈 RNA(dsRNA)的結(jié)構(gòu)類似物，作為免疫佐劑其抗腫瘤作用已經(jīng)得到了證實(shí)，并且在多種抗腫瘤臨床試驗(yàn)中取得了一定的療效［6］。研究證實(shí)，poly(I：C)是 TLR3、RIG-I、MDA5 等多種RLR 的激動(dòng)劑［7，8］，可通過(guò)活化下游信號(hào)通路進(jìn)而通過(guò)cross-talking在多種癌癥中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活天然免疫應(yīng)答，進(jìn)而引起全身性適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前已經(jīng)在黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌及白血病等癌癥中發(fā)現(xiàn)了poly(I：C)具有直接或間接的抗腫瘤效果［4］。因此，基于 poly(I：C)的腫瘤生物治療藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。

越來(lái)越多的研究證實(shí)，TLR3不僅廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及角化細(xì)胞中，在多種腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)［2］。本研究在胃腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)到TLR3 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，提示在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中TLR3也許起到了一定的作用。本研究中，外加 poly(I：C)可以觀察到胃腺癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞中細(xì)胞膜TLR3表達(dá)水平的升高，因此，poly(I：C)可以至少部分通過(guò)活化BGC-823細(xì)胞的TLR3信號(hào)通路影響該細(xì)胞的生物學(xué)特征。

我們觀察到，poly(I：C)可以明顯抑制BGC-823細(xì)胞增殖，但是對(duì)細(xì)胞的凋亡沒(méi)有明顯作用(數(shù)據(jù)未顯示);同時(shí)，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)下降、DNA合成減少。說(shuō)明poly(I：C)主要影響了BGC-823細(xì)胞的周期。炎癥的產(chǎn)生伴隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。本研究中觀察到 poly(I：C)處理 BGC-823細(xì)胞后，炎癥因子TNF-α和IL-8的mRNA表達(dá)水平下降，IL-6 mRNA表達(dá)水平上升;另外，poly(I：C)處理的BGC-823細(xì)胞中TGF-β mRNA表達(dá)水平下降。TGF-β是一類多重功能的免疫抑制細(xì)胞因子，研究表明該因子與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在許多腫瘤組織中高表達(dá)，在胃癌中表達(dá)也高于正常胃黏膜組織［10］。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腫瘤組織中的TGF-β可以通過(guò)抑制免疫細(xì)胞的增殖、活化、分化以及向腫瘤組織的遷移而抑制免疫應(yīng)答，同時(shí)促進(jìn)血管、淋巴管生成，引起腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［11，12］。因此，poly(I：C)可能通過(guò)降低TGF-β的分泌，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷功能，從而起到解除腫瘤免疫抑制的作用。

綜上所述，本研究證實(shí)，poly(I：C)不僅可以抑制BGC-823細(xì)胞增殖，而且還通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子和免疫抑制因子表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能，影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。本研究為poly(I：C)用于臨床治療胃癌提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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