王婷婷 徐 曼 耿衛(wèi)樸 黃文煉 陳 瑜

(重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室重慶醫(yī)科大學(xué)分子與腫瘤研究中心，重慶400016)

宮頸癌是我國女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年升高且發(fā)病年齡趨于年輕化［1］。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與子宮頸局部T細(xì)胞對癌變細(xì)胞的免疫監(jiān)視和清除功能低下有關(guān)［2］。惡性腫瘤局部微環(huán)境免疫水平低下與多種因素有關(guān)，包括局部出現(xiàn)負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子B7家族成員、調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg細(xì)胞，F(xiàn)OXP3+細(xì)胞)和抑制性細(xì)胞因子TGF-β1增多等［3］。宮頸癌微環(huán)境中浸潤的 T 淋巴細(xì)胞包括 CD4+T、CD8+T和 FOXP3+調(diào)節(jié) T細(xì)胞(Treg)，而且腫瘤內(nèi)浸潤的FOXP3+/CD8+T下降是宮頸癌患者獨立的預(yù)后不良因素［4］。研究發(fā)現(xiàn)共刺激分子B7家族成員B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PDL2)和B7-H4(B7S1)與活化的T淋巴細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫，在下調(diào)腫瘤局部微環(huán)境的抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用［5］。Karim等［6］證實人子宮頸癌組織異常表達(dá)B7-H1和B7-DC，腫瘤內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞表達(dá)B7-H1和B7-DC的受體。我們前期對人子宮頸癌的回顧性研究發(fā)現(xiàn)B7-H1和B7-DC均異常表達(dá)，且B7-H1和B7-DC的表達(dá)與腫瘤內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞減少有關(guān)，但與浸潤的CD4+T細(xì)胞數(shù)量無關(guān)［7，8］。近期文獻(xiàn)報道肺癌、食管癌、胃癌、惡性黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞異常表達(dá)B7-H4，其表達(dá)與腫瘤局部微環(huán)境內(nèi)浸潤的T細(xì)胞免疫抑制以及患者預(yù)后差有關(guān)［9-11］。為了探明B7-H4在人子宮頸癌的表達(dá)情況及其對宮頸局部微環(huán)境T細(xì)胞免疫的影響，本文采用免疫組織化學(xué)染色法檢測了67例人宮頸癌B7-H4的表達(dá)，免疫熒光染色觀察了腫瘤內(nèi)浸潤的FOXP3+、CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)量及其TGF-β1和IFN-γ分泌情況，并分析了B7-H4表達(dá)與腫瘤內(nèi)浸潤的各亞群T細(xì)胞數(shù)量及其細(xì)胞因子分泌的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實驗材料 收集重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室2009～2010年手術(shù)切除標(biāo)本，其中正常子宮頸組織30例、高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasiaⅡ-Ⅲ，CINⅡ-Ⅲ)30例。子宮頸癌67例(鱗狀細(xì)胞癌60例，腺癌7例)，患者平均年齡43.12歲(32～65歲)。標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。

1.2實驗試劑 兔抗人B7-H4(bs-0673R)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，羊抗鼠IgG-FITC、羊抗兔IgG-TRITC和PV-6000試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。鼠抗人CD4(MAB-0251)、兔抗人CD8(RMA-0514) 、兔抗人TGF-β1(RAB-0238)抗體購自福州邁新公司，鼠抗人FOXP3+(14-4777-82)抗體購自美國 eBioscience公司，鼠抗人 IFN-γ(ab82447)抗體購自美國Abcam公司。

1.3實驗方法

1.3.1B7-H4免疫組化染色及結(jié)果判定 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，10%H2O2室溫孵育10分鐘，Tris-EDTA(pH9.0)微波抗原修復(fù)并經(jīng)PBS洗滌，加山羊血清室溫孵育20分鐘后滴加B7-H4抗體(1∶100)4℃過夜，PBS洗3次后，滴加山羊抗兔抗體37℃孵育30分鐘，DAB顯色。以PBS代替一抗作為陰性對照。蘇木精復(fù)染后中性樹脂封片鏡檢。B7-H4在胞膜/胞漿棕黃色染色為陽性，無染色為陰性。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用半定量分級法：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;細(xì)胞染色強(qiáng)度，陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)與相應(yīng)染色強(qiáng)度乘積判定染色結(jié)果：0～1分為陰性;2～7分為陽性，其中2～5分為+～++，6＞分為+++。

1.3.2T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的免疫熒光雙標(biāo)檢測及結(jié)果判定 切片預(yù)處理同上。滴加抗FOXP3，抗CD4和抗TGF-β1或抗CD8和抗IFN-γ抗體于4℃過夜。PBS-T洗3次，分別加入山羊抗兔IgG-FITC和山羊抗鼠IgG-TRITC，PBS洗3次后甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察。CD8+T和TGF-β1陽性細(xì)胞呈橙紅色，CD4+T、IFN-γ及FOXP3陽性細(xì)胞呈綠色，CD8+T和CD4+T陽性表達(dá)于細(xì)胞膜，TGF-β1和IFN-γ陽性表達(dá)于細(xì)胞漿，而FOXP3+陽性表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。陰性細(xì)胞不顯色。每例隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)照相并分別計數(shù)各陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，應(yīng)用秩和檢驗和Fisher＇s確切概率法數(shù)據(jù)比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1B7-H4在正常人子宮頸上皮、高級別CIN和子宮頸癌的表達(dá) B7-H4在正常人宮頸上皮無表達(dá)，在極少部分高級別CIN的瘤變上皮弱陽性表達(dá)。B7-H4在宮頸癌細(xì)胞的陽性表達(dá)率為46%(31/67)，顯著高于正常人子宮頸上皮和瘤變的宮頸上皮 (P＜0．01，P＜0．01，見圖 1，表 1)。此外，宮頸癌局部的間質(zhì)細(xì)胞散在表達(dá)B7-H4。

2.2子宮頸癌內(nèi)浸潤的FOXP3+、CD4+T和CD8+T細(xì)胞 子宮頸癌內(nèi)浸潤的T淋巴細(xì)胞主要分布于鱗狀細(xì)胞癌癌巢周圍的間質(zhì)，癌巢內(nèi)偶見個別T淋巴細(xì)胞浸潤。子宮頸腺癌間質(zhì)內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞相對較少。計數(shù)分析毎例宮頸癌5個高倍視野浸潤的FOXP3+T、CD4+T和CD8+T細(xì)胞平均數(shù)分別為106.23±89.15、22.04±13.37和241.52±226.49(圖2)。

圖1 B7-H4在子宮頸上皮和宮頸癌的表達(dá)Fig．1 B7-H4 expression in human cervical epithelium and cervical cancer

圖2 子宮頸鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)浸潤的T淋巴細(xì)胞(IF，×400)Fig．2 Tumor-infiltrating T lymphocytes in cervical squamous cell carcinomas(IF，×400)

表1 B7-H4在宮頸上皮和宮頸癌的表達(dá)Tab．1 The expression of B7-H4 in human cervical epithelium and cervical cancers

表2 宮頸癌中B7-H4的表達(dá)及浸潤T細(xì)胞數(shù)量Tab．2 The expression of B7-H4 and the number of tumorinfitlating T lymphocytes in cervical cancers

表3 宮頸癌組織內(nèi)分泌細(xì)胞因子的T細(xì)胞數(shù)量Tab．3 The number of cytokine secreting T lymphocytes in cervical cancers

2.3子宮頸癌表達(dá)B7-H4與FOXP3+、CD4+T和CD8+T細(xì)胞浸潤的相關(guān)性 B7-H4陽性宮頸癌內(nèi)浸潤的FOXP3+細(xì)胞平均數(shù)略多于B7-H4陰性組，但兩組間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。B7-H4陽性組子宮頸癌組織中浸潤的CD4+T細(xì)胞平均數(shù)少于B7-H4陰性組，但兩組間也無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。B7-H4陽性組宮頸癌浸潤的CD8+T細(xì)胞平均數(shù)顯著少于B7-H4陰性組(P＜0.001，表2)。

2.4宮頸癌表達(dá)B7-H4與浸潤T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的關(guān)系 免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示宮頸癌內(nèi)浸潤的大部分CD4+T細(xì)胞分泌 TGF-β1，但分泌 IFN-γ的CD8+T細(xì)胞明顯減少。B7-H4陽性宮頸癌組分泌TGF-β 1的CD4+T細(xì)胞數(shù)略少于B7-H4陰性組，但兩組間無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。B7-H4陽性組分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著少于B7-H4陰性組(P＜0.05，見圖3、4，表3)。

圖3 宮頸癌內(nèi)浸潤的CD4+T、CD8+T及分泌的TGF-β1和IFN-γ(IF，×400)Fig．3 Tumor-infiltrating CD4+T/TGF-β1cells and CD8+T/IFN-γ cells in cervical cancers(IF，×400)

圖4 宮頸癌B7-H4表達(dá)及腫瘤內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞Fig．4 The expression of B7-H4 and tumor-infiltrating CD8+T lymphocytes in cervical cancers

3 討論

人子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展與宿主宮頸局部微環(huán)境的免疫監(jiān)視功能低下尤其是T細(xì)胞的免疫功能低下有關(guān)。由于腫瘤微環(huán)境T細(xì)胞免疫受到負(fù)性共刺激分子B7家族成員、FOXP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞和TGF-β1等多種因素的調(diào)控［12］，本實驗對這些因素進(jìn)行了綜合分析。

我們首先對B7-H4在正常人子宮頸上皮、瘤變的宮頸上皮和宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行免疫組化研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常人子宮頸上皮不表達(dá)B7-H4;少數(shù)高級別CIN瘤變上皮微弱表達(dá)B7-H4;但宮頸癌細(xì)胞B7-H4的表達(dá)顯著增高，陽性率為46%(31/67)。此外，子宮頸癌間質(zhì)內(nèi)也有散在細(xì)胞表達(dá)B7-H4。文獻(xiàn)也報道多種惡性腫瘤表達(dá)B7-H4，且B7-H4的表達(dá)與腫瘤分期、病理學(xué)類型、患者預(yù)后、患者生存率等有關(guān);Kryczek等［13］還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的巨噬細(xì)胞表達(dá)B7-H4，這些B7-H4+細(xì)胞抑制了腫瘤相關(guān)特異性抗原的T細(xì)胞免疫。因此，我們推測宮頸癌細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞異常表達(dá)B7-H4可能參與抑制宮頸局部T細(xì)胞免疫。

我們進(jìn)一步對宮頸癌B7-H4的表達(dá)與局部浸潤的T細(xì)胞亞群進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)宮頸癌局部微環(huán)境內(nèi)浸潤的CD4+T細(xì)胞數(shù)量少，而FOXP3+細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量多，該結(jié)果與Bedoya等［14］的實驗結(jié)果一致;B7-H4的表達(dá)與浸潤的CD4+T細(xì)胞以及FOXP3+細(xì)胞數(shù)量無相關(guān)性，但與浸潤的CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少明顯相關(guān)。Sun等［15］也發(fā)現(xiàn)B7-H4陽性的非小細(xì)胞肺癌腫瘤內(nèi)浸潤的T淋巴細(xì)胞少于B7-H4陰性的非小細(xì)胞肺癌，但未對浸潤的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分類。Park等［16］觀察到B7-H4有抑制瘤變的B淋巴細(xì)胞增殖的作用，該作用主要通過下調(diào)蛋白激酶AKT通路，下調(diào)CDK4/6、Cyclin E/D的表達(dá)以及上調(diào)P21水平，從而使B細(xì)胞淋巴瘤被阻滯在細(xì)胞周期的G0/G1期，抑制了細(xì)胞的增殖。我們用重組人B7-H4與人的外周血T細(xì)胞混合培養(yǎng)，也觀察到B7-H4使活化增殖的T細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，而處于S期的細(xì)胞減少(結(jié)果未顯示)，因此我們推測B7-H4陽性的宮頸癌內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少與B7-H4阻止CD8+T細(xì)胞增殖有關(guān)，但為何B7-H4對CD4+T和FOXP3+細(xì)胞無明顯作用尚待進(jìn)一步研究。

在觀察宮頸癌微環(huán)境內(nèi)浸潤的CD4+T細(xì)胞分泌TGF-β1和CD8+T分泌 IFN-γ后，我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)B7-H4的宮頸癌病例不僅腫瘤內(nèi)浸潤的CD8+T細(xì)胞減少，而且分泌IFN-γ的CD8+T數(shù)量也明顯減少，但B7-H4的表達(dá)與腫瘤內(nèi)浸潤的CD4+T細(xì)胞數(shù)量及其分泌TGF-β1無明顯相關(guān)性。CD8+T細(xì)胞作為主要的抗腫瘤效應(yīng)T細(xì)胞，分泌的IFN-γ水平直接反映其功能狀態(tài)。B7-H4陽性的宮頸癌微環(huán)境內(nèi)分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞明顯減少，提示B7-H4不僅使活化早期的CD8+T細(xì)胞增殖受到抑制，同時也下調(diào)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒功能，從而抑制了宮頸局部的抗腫瘤 T細(xì)胞免疫。Sica等［17］也報道 B7-H4陽性細(xì)胞能抑制早期活化T細(xì)胞的細(xì)胞周期運行，使其停留在G0/G1期，并能抑制CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞的成熟和分泌細(xì)胞因子IFN-γ及IL-2，該實驗結(jié)果與我們的觀察結(jié)果一致。

總之，本實驗結(jié)果證實B7-H4在子宮頸癌中異常表達(dá)，抑制了腫瘤內(nèi) CD8+T細(xì)胞浸潤和分泌IFN-γ，提示B7-H4在抑制抗腫瘤細(xì)胞免疫中起到重要作用。隨著研究者們對共刺激分子負(fù)性調(diào)節(jié)抗腫瘤細(xì)胞免疫的認(rèn)識不斷深入，采用相應(yīng)的抑制劑阻斷其免疫抑制作用已成為腫瘤免疫治療研究的新熱點，B7-H4可能成為子宮頸癌免疫治療的新靶點。

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