宋曉環(huán) 王曉林 孫冬梅 王忠超 高 航 (長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，長(zhǎng)春130021)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，居內(nèi)分泌系統(tǒng)及頭頸部惡性腫瘤的第一位，也是近年來(lái)發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤之一。甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制目前還不清楚，但與其它腫瘤一樣，甲狀腺癌的發(fā)生與基因突變密切相關(guān)，控制細(xì)胞分化的基因異常表達(dá)或停止表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。TBX2是T-BOX基因家族成員之一，屬于發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因。有研究發(fā)現(xiàn)TBX2在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可視為新的腫瘤標(biāo)志物。但TBX2在甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)了TBX2mRNA在甲狀腺癌組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義，以期為甲狀腺癌的臨床診斷及治療提供指導(dǎo)與靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 選取吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系及吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院2007～2009年甲狀腺腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本80例，另選正常甲狀腺組織標(biāo)本9例。所有標(biāo)本整理標(biāo)記好后均進(jìn)行中性福爾馬林固定，保存于-80℃冰箱中，用于組織勻漿后提取組織總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)目的基因mRNA的表達(dá)水平。甲狀腺腫瘤石蠟包埋組織切片經(jīng)HE染色后，由病理學(xué)系兩位臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生雙盲閱片區(qū)分組織類(lèi)型，結(jié)果為甲狀腺腺瘤13例，甲狀腺乳頭狀癌(PTC)28例，甲狀腺濾泡癌(FTC)23例，甲狀腺髓樣癌(MTC)14例，甲狀腺未分化癌(UTC)2例。

1.2RT-PCR 取實(shí)驗(yàn)用正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織，Trizol法提取組織總 RNA作為模板。應(yīng)用Primer Premier5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物：TBX2 引物：上游引物：5＇-CAC TCG CTT GAC CGA ACC C-3＇，下游引物：5＇-CGC ACT GTC TGT CTG CAC CA-3＇，特異性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為211 bp;GAPDH(內(nèi)參照)引物：上游引物：5＇-GGG TGA TGC TGG TGC TGA GTA TGT-3＇，下游引物：5＇-AAG AAT GGG AGT TGC TGT TGA AGT C-3＇，特異性擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為616 bp。按照北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品2×Taq PCR MasterMix使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：TBX2：94℃ 3分鐘，94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃ 1分鐘，30個(gè)循環(huán);72℃ 10分鐘;GAPDH：94℃ 3分鐘，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 1分鐘，25個(gè)循環(huán);72℃ 5分鐘。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后紫外光下拍照。應(yīng)用天能凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)電泳圖進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度的半定量分析。實(shí)驗(yàn)用引物、DNA Marker(DL-2000)均購(gòu)自大連寶生物公司。

1.3結(jié)果判定 用內(nèi)參照(GAPDH)光密度值標(biāo)化TBX2mRNA的光密度值進(jìn)行半定量分析，得到TBX2mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。具體計(jì)算公式如下：TBX2mRNA相對(duì)含量=(TBX2光密度值/GAPDH光密度值)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表1。

2.2TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌及甲狀腺髓樣癌(甲狀腺未分化癌例數(shù)太少，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)組織中的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度(相對(duì)系數(shù))分別為0.932±0.256、1.283 ±0.354、1.776 ±0.382、2.627 ±0.532、2.937 ±0.481(見(jiàn)圖 1、2)。

圖1 TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達(dá)Fig．1 The expression of TBX2mRNA in normal thyroid，thyroid adenoma and thyroid carcinoma

表1 TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達(dá)Tab．1 The expression of TBX2mRNA in normal thyroid gland，thyroid adenoma and thyroid carcinoma

圖2 TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中的表達(dá)Fig．2 The expression of TBX2 in normal thyroid ，thyroid adenoma and thyroid carcinoma

3 討論

TBX2基因是T-BOX基因家族成員之一，屬發(fā)育調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因，人TBX2基因位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)3帶(17q23)，該基因的同源基因位于鼠的11號(hào)染色體上。其編碼蛋白主要通過(guò)其C末端的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用［1］。TBX2在胚胎發(fā)育的各種組織和器官中廣泛表達(dá)，對(duì)胚胎的形成和組織器官的發(fā)育成熟起非常重要的作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，TBX2在多種腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌等。TBX2可從多方面促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展：可以通過(guò)抑制p14ARF-Mdm2-p53通路的關(guān)鍵蛋白p14ARF的活性而使細(xì)胞周期停止在G1/S 和 (或)G2/M 期［2］;或是協(xié)同 Myc、Ras等基因作用使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化等［3］;TBX2還可能參與了腫瘤化療藥物耐藥性的產(chǎn)生［4-6］;并有可能成為腫瘤治療的有效靶點(diǎn)［7，8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，TBX2mRNA在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤及甲狀腺癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為33.3%、46.2%和83.6%。經(jīng)比較，TBX2mRNA在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)高于其在正常甲狀腺組織、甲狀腺腺瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)，P＜0.05，差異有顯著性。TBX2 mRNA在不同分化程度的甲狀腺癌組織中與在正常甲狀腺、甲狀腺腺瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度相比較，P＜0.01，差異有顯著性。提示TBX2 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達(dá)有一定的特異性。TBX2mRNA在甲狀腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與甲狀腺癌組織的分化程度及組織學(xué)分型有關(guān)：TBX2mRNA陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度越強(qiáng)，甲狀腺癌組織分化程度越低、惡性程度越高。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與宋曉環(huán)等［9］應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TBX2在甲狀腺癌組織中的表達(dá)，陳平等［10］檢測(cè)TBX2在正常胰腺組織及胰腺癌組織中的表達(dá)，徐傲等［11］檢測(cè)TBX2在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)結(jié)果性質(zhì)一致;提示TBX2同樣也參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為，TBX2參與了甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程并起一定的促進(jìn)作用，TBX2在甲狀腺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)可能是甲狀腺癌惡性程度高，增殖迅速的原因之一。檢測(cè)其在甲狀腺癌組織中的表達(dá)可為甲狀腺癌的臨床診斷、惡性程度的判定及預(yù)測(cè)預(yù)后提供重要的參考指標(biāo)。TBX2有可能成為臨床診斷、治療甲狀腺癌的一個(gè)新靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。

1 Minguillon C，Logan M.The comparative genomics of T-box genes［J］.Brief Funct Genomic Proteomic，2003;2(3)：224-233.

2 Chaubert P，Burri N，Cousin P et al．A novel highly informative polyA microsatellite on the telomeric side of the INK4a/ARF locus［J］.Mol Cell Probes，2001;15(3)：183-185.

3 鄭文婕，童坦君，張宗玉.細(xì)胞衰老的重要通路：p16INK4a/Rb和p19ARF/p53/p21Cip1信號(hào)途徑［J］.生命的化學(xué)，2002;22(4)：314-316.

4 Bilican B，Goding C R.Cell cycle regulation of the T-box transcription factor tbx2 ［J］.Exp Cell Res，2006;312(12)：2358-2366.

5 Guo C F，Zu Z W.Transfer of p14ARF gene in drug-resistant human breast cancer MCF-7/Adr cells inhibits proliferation and reduces doxorubicin resistance ［J］.Chin Cancer Res，2000;158(2)：203-210.

6 Deng X Y，Kim M，Vandier D et al．Recombinant adenovirus-mediated p14(ARF)overexpression sensitizes human breast cancer cells to cisplatin［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002;296(4)：792-798.

7 Vance K W，Carreira S，Brosch G et al．Tbx2 is overexpressed and plays an important role in maintaining proliferation and suppression of senescence in melanomas［J］. CancerRes，2005;65(6)：2260-2268.

8 Butz N V，Campbell C E，Gronostajski R M.Differential target gene activation by TBX2 and TBX2VP16：evidence for activation domaindependent modulation of gene target specificity［J］.Gene，2004;342(1)：67-76.

9 宋曉環(huán)，李 偉，孫冬梅et al．轉(zhuǎn)錄抑制基因TBX2在甲狀腺癌中的表達(dá)及其臨床病理意義［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;19(31)：3696-3697.

10 陳 平，田德安，劉 梅et al.Tbx2蛋白在胰腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)及其意義［J］.臨床內(nèi)科雜志，2007;24(5)：341-343.

11 徐 傲，陳 柯，郭真理 et al．子宮內(nèi)膜樣腺癌中TXB2、PAX9的表達(dá)及其相關(guān)性［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012;28(2);158-161.