梁錦屏 謝建寧 王大軍 周 婭 (寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，銀川750004)

近年來隨著固有免疫識(shí)別機(jī)制的突破性進(jìn)展與內(nèi)毒素(主要成分脂多糖，即LPS)致病機(jī)理的深入研究，為內(nèi)毒素疾病的防治提供了新的思路。LPS是革蘭陰性菌的主要病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)，進(jìn)入機(jī)體后，固有免疫系統(tǒng)主要通過脂多糖結(jié)合蛋白(LPS binding protein，LBP)、CD14(Cluster of differentiation 14)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)等模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識(shí)別 LPS，激活TLR4炎癥通路［1］，促使內(nèi)源性介質(zhì)釋放和炎癥因子的過度分泌，造成全身組織器官損傷和功能紊亂。其中肺臟是最早受累器官之一，可引起急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)、甚至急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)［2］。

槐定堿(Sophoridine)是苦豆子等中草藥的天然提取物，具有抗腫瘤、保護(hù)心肌、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性［3］。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)槐定堿可減輕內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織的病理損害［4］。為具體探討槐定堿抗內(nèi)毒素作用的藥理機(jī)制，本研究從LPS激活的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，動(dòng)態(tài)觀察槐定堿對(duì)LPS識(shí)別受體LBP、CD14、TLR4的影響，為槐定堿防治內(nèi)毒素性肺損傷提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 槐定堿(批號(hào)：960324，含量98%以上)購自寧夏藥物研究所，其小鼠腹腔注射LD50為 58.0 mg/kg;LPS(E.coli 055∶B5，批號(hào)：63H4010)購自Sigma公司;RT-PCR試劑盒購于美國Promega公司;DNA marker購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗小鼠TLR4多克隆抗體，美國Santa Cruz公司;辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物有限公司;小鼠TNF-α放免分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司;PCR儀、核酸濃度測(cè)定儀、凝膠成像儀、電泳儀均為美國Bio-RAD公司;旋渦混合器(上海第一醫(yī)學(xué)儀器廠XW-80型);γ放射免疫計(jì)數(shù)儀(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司GC-1200)。

1.2動(dòng)物分組 6～8周齡 BALB/c小鼠，18～22 g，雌雄各半，寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)：SCXK(寧)2005-2001)。BALB/c小鼠試驗(yàn)前自由攝取食水。隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、內(nèi)毒素血癥模型組(LPS模型組)、槐定堿藥物對(duì)照組(SRI組，12 mg/kg)、槐定堿干預(yù)三個(gè)劑量組［LPS+SRI組，12 mg/kg(高)、6 mg/kg(中)、3 mg/kg(低)］。每一大組再分為2、6、12、24小時(shí)4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，共24個(gè)小組，每組10只。①正常對(duì)照組：尾靜脈注射生理鹽水0.1 ml/10 g，②內(nèi)毒素血癥模型組：尾靜脈注射LPS 7 mg/kg，①②兩組30分鐘后，均腹腔注射生理鹽水0.2 ml/10g;③～⑤槐定堿高、中、低劑量干預(yù)組：尾靜脈注射LPS 7 mg/kg，30分鐘后，分別腹腔注射槐定堿12 mg/kg、6 mg/kg、3 mg/kg;⑥槐定堿藥物對(duì)照組：尾靜脈注射生理鹽水0.1 ml/10 g，30分鐘后腹腔注射槐定堿12 mg/kg。各組在處理完畢后的2、6、12、24小時(shí)4個(gè)時(shí)相點(diǎn)分別取材。

1.3檢測(cè)指標(biāo) ①肺臟的形態(tài)學(xué)觀察：肉眼觀察肺臟大體形態(tài);取一肺葉固定、包埋、HE染色，光鏡觀察。②肺水含量：剝離左肺，用吸水紙吸干表面血跡，電子天平稱取左肺濕重(W)，然后置80℃干烤箱72小時(shí)至恒重，再稱干重(D)。計(jì)算左肺濕/干重值(W/D)。③血清腫瘤壞死因子(TNF-α)含量：小鼠摘眼球取血，3 000 r/min離心10分鐘，留血清，按放免試劑盒說明書操作，γ放免計(jì)數(shù)儀檢測(cè)。④RT-PCR檢測(cè)肺組織LBP、CD14和TLR4 mRNA表達(dá)水平：提取小鼠肺組織總 RNA，按照一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作。引物由北京賽百盛公司合成，序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，Bio-Image Analysis System進(jìn)行半定量分析，mRNA相對(duì)含量=目的基因條帶的相對(duì)光密度值 (ROD)×面積(mm2)/β-actin條帶的ROD×mm2。⑤Western blot檢測(cè)肺組織TLR4蛋白表達(dá)。肺組織勻漿，提取總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。加樣40 μg/孔，以 10%SDS-PAGE 電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜和封閉后，加小鼠 TLR4一抗(1∶500);4℃過夜，PBS-T洗膜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，室溫放置2小時(shí)，洗膜，四氯-1-萘酚顯色。凝膠圖像分析系統(tǒng)成像、掃描分析，以TLR4條帶面積灰度值與β-actin條帶面積灰度值的比值作為TLR4蛋白相對(duì)含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間比較用LSD法。

表1 目的基因序列與擴(kuò)增長(zhǎng)度Tab．1 Primer sequences and PCR products(bp)

2 結(jié)果

2.1槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺臟病理形態(tài)學(xué)影響。

2.1.1肉眼觀察 正常對(duì)照組與槐定堿對(duì)照組小鼠肺臟外觀未見異常改變，而LPS模型組小鼠在2小時(shí)時(shí)即可見肺臟充血，隨時(shí)間延長(zhǎng)病變加重，至6、12、24小時(shí)時(shí)肺臟不僅明顯充血水腫，還有出血，多為出血點(diǎn)，有的已呈斑片狀出血灶甚至胸腔內(nèi)出血?；倍▔A三個(gè)劑量干預(yù)組各時(shí)相點(diǎn)小鼠肺臟病變均較同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組明顯減輕，僅幾只小鼠肺組織充血水腫明顯，肺表面僅見少量散在淺紅色滲血。

2.1.2光鏡觀察 正常對(duì)照組與槐定堿對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔清晰，偶見肺泡間隔輕度增寬，支氣管黏膜上皮完整。LPS模型組2小時(shí)時(shí)無明顯變化，隨時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織病理變化明顯加重。6、12小時(shí)組可見肺臟有廣泛而強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，肺泡腔內(nèi)有滲出物，有的肺泡出現(xiàn)代償性肺氣腫，嚴(yán)重的間質(zhì)性肺炎，大量中性粒細(xì)胞及少量單核細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張及間質(zhì)小靜脈擴(kuò)張出血，偶可見支氣管上皮纖毛倒伏;24小時(shí)組損傷亦未見減輕。槐定堿三個(gè)劑量干預(yù)組12小時(shí)與24小時(shí)時(shí)相點(diǎn)，與同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組比較肺組織炎癥損傷明顯減輕(圖1)。

圖1 光鏡觀察各組小鼠肺組織病理變化(24小時(shí)相點(diǎn)，HE×100)Fig．1 Pathological change of lung tissue of each mouse group by light microscopy(24 h，HE ×100)

2.2槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺臟含水量的影響(左肺W/D值) 6、12小時(shí)時(shí)相點(diǎn)槐定堿高、中、低3個(gè)劑量組與同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組的W/D值比較均顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);并與正常對(duì)照組無顯著差異?；倍▔A高、中、低三個(gè)劑量組同時(shí)相點(diǎn)之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.3槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織LBP、CD14、TLR4的mRNA表達(dá)的影響

2.3.1肺組織LBP mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 槐定堿三個(gè)劑量干預(yù)組除2小時(shí)時(shí)相點(diǎn)外，其余各時(shí)相點(diǎn)肺組織LBP mRNA表達(dá)水平均較同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組顯著降低(P＜0.01或P＜0.05);大多數(shù)與同時(shí)相點(diǎn)正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(除外槐定堿高劑量6、24 小時(shí)組，圖 3、4)。

2.3.2肺組織CD14 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化 槐定堿三個(gè)劑量干預(yù)組除2小時(shí)時(shí)相點(diǎn)外，其余各時(shí)相點(diǎn)肺組織CD14 mRNA表達(dá)水平均較LPS模型組降低(P＜0.01);除槐定堿高、中劑量2、6小時(shí)組外，其余槐定堿干預(yù)組的肺組織CD14 mRNA表達(dá)水平也與同時(shí)相點(diǎn)正常對(duì)照組無顯著差異?；倍▔A高、中、低三個(gè)劑量組同時(shí)相點(diǎn)之間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5、6)。

圖2 槐定堿對(duì)小鼠肺臟含水量的影響Fig．2 Effect of Sophoridine on content of lung water of endotoxemia mice

圖3 槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織LBP mRNA表達(dá)的影響Fig．3 Effect of Sophoridine on the expression of LBP mRNA in lung tissue of endotoxemia mice

圖4 RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織LBP mRNA表達(dá)Fig．4 Expression of LBP mRNA in lung tissue of each mouse group by RT-PCR

圖5 槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)的影響Fig．5 Effect of Sophoridine on the expression of CD14 mRNA in lung tissue of endotoxemia mice

圖6 RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織CD14 mRNA表達(dá)Fig．6 Expression of CD14 mRNA in lung tissue of each mouse group by RT-PCR

2.3.3肺組織中TLR4 mRNA表達(dá) 槐定堿三個(gè)劑量干預(yù)組各個(gè)時(shí)相點(diǎn)均下調(diào)了TLR4 mRNA的表達(dá)(P＜0.01或P＜0.05)，但仍顯著高于同時(shí)相點(diǎn)正常對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.05)，直至24小時(shí)時(shí)三個(gè)劑量組TLR4 mRNA表達(dá)方降至正常對(duì)照組水平?；倍▔A高、中、低三個(gè)劑量組同時(shí)相點(diǎn)之間比較TLR4 mRNA表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖7、8)。

圖7 槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織TLR4 mRNA表達(dá)的影響Fig．7 Effect of Sophoridine on the expression of TLR4 mRNA in lung tissue of endotoxemia mice

圖8 RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肺組織TLR4 mRNA表達(dá)Fig．8 Expression of TLR4 mRNA in lung tissue of each mouse group by RT-PCR

圖9 槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)的影響Fig．9 Effect of Sophoridine on the expression of TLR4 protein in lung tissue of endotoxemia mice

2.4槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)的影響 各組小鼠肺組織中TLR4蛋白表達(dá)趨勢(shì)與其mRNA相似，槐定堿三個(gè)劑量干預(yù)組2、6、12小時(shí)三個(gè)時(shí)相點(diǎn)TLR4蛋白表達(dá)均較同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組顯著降低(P＜0.05);與TLR4 mRNA表達(dá)不同的是，24小時(shí)時(shí)包括 LPS模型組在內(nèi)的各組TLR4蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。槐定堿高、中、低三個(gè)劑量組同時(shí)相點(diǎn)之間比較TLR4蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9、10)。

圖10 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá)(12小時(shí)時(shí)相點(diǎn))Fig．10 Expression of TLR4 protein in lung tissue of each mouse group by Western blot(12 h)

圖11 槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠血清TNF-α的影響Fig．11 Effect of Sophoridine on the level of serum TNF-α of endotoxemia mice

2.5槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠血清腫瘤壞死因子(TNF-α)含量的影響 槐定堿高、中劑量干預(yù)組小鼠血清TNF-α含量均低于同時(shí)相點(diǎn) LPS模型組(P＜0.01或P＜0.05)，并在 6、12、24小時(shí)時(shí)均接近同時(shí)相點(diǎn)正常對(duì)照組;但槐定堿低劑量干預(yù)組僅6小時(shí)時(shí)TNF-α含量低于LPS模型組，各時(shí)相點(diǎn)均高于正常對(duì)照組(均P＜0.01)?；倍▔A三個(gè)劑量組同時(shí)相點(diǎn)之間比較，高、中劑量組血清TNF-α含量低于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05，圖11)。

3 討論

在固有免疫識(shí)別的PAMP中，LPS是研究較為深入的一種。當(dāng) G-菌感染，LPS釋出后，即被LBP、CD14、TLR4等模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別，并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。所以說LPS識(shí)別受體是炎癥反應(yīng)發(fā)生的起步點(diǎn)。其中LBP和CD14是體內(nèi)重要的脂多糖增敏系統(tǒng)，能極大提高多種細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素的敏感性，對(duì)結(jié)合的LPS信號(hào)起著“放大器”的作用［6，7］。本實(shí)驗(yàn)中 LPS模型組小鼠在尾靜脈注入LPS后2小時(shí)肺組織中 LBP、CD14、TLR4 mRNA表達(dá)均迅速上調(diào)，并于6小時(shí)達(dá)高峰，至24小時(shí)仍維持在高表達(dá)水平，各時(shí)相點(diǎn)表達(dá)水平均顯著高于同時(shí)相點(diǎn)正常對(duì)照組(P＜0.01);TLR4蛋白表達(dá)趨勢(shì)與TLR4 mRNA基本一致，與TLR4mRNA不同的是至24小時(shí)已降至正常水平。根據(jù)已知的LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，本研究制備模型時(shí)注入小鼠體內(nèi)的LPS首先與血清LBP結(jié)合，再被轉(zhuǎn)運(yùn)至肺泡巨噬細(xì)胞表面結(jié)合CD14。此時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞上CD14表達(dá)升高，才可結(jié)合更多的LPS-LBP復(fù)合物，而LPS結(jié)合數(shù)量的增多和結(jié)合效率的提高，又使其生物學(xué)效應(yīng)得以最大程度的發(fā)揮。此后CD14傳遞的LPS被TLR4識(shí)別并結(jié)合，TLR4發(fā)生二聚化，募集下游的銜接蛋白，將 LPS信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)［8-10］。本實(shí)驗(yàn)中TLR4在模型小鼠肺組織表達(dá)的上調(diào)顯然亦是LPS作用的結(jié)果，因?yàn)橐勾罅勘籆D14結(jié)合的LPS分子有足夠的跨膜受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，只有上調(diào)TLR4分子的表達(dá)，才能將LPS信號(hào)轉(zhuǎn)至胞內(nèi)，進(jìn)一步激活下游的炎癥因子通路。而大量炎癥細(xì)胞因子又可促進(jìn)CD14和TLR4的表達(dá)，以提高LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。這樣，肺組織中LBP、CD14和TLR4的高表達(dá)與LPS所致肺臟炎癥之間形成的正反饋?zhàn)饔?，加重肺臟的局部炎癥，最終發(fā)展為ALI和ARDS。

本研究用槐定堿高、中、低三個(gè)劑量干預(yù)內(nèi)毒素血癥肺損傷小鼠，在不同時(shí)相點(diǎn)都觀察到槐定堿干預(yù)組肺組織 LBP、CD14 mRNA表達(dá)以及 TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)均較同時(shí)相點(diǎn)LPS模型組顯著下降，在12小時(shí)和24小時(shí)時(shí)相點(diǎn)槐定堿三個(gè)劑量干預(yù)組上述各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)多數(shù)已與正常對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模式識(shí)別受體的下調(diào)，同時(shí)再結(jié)合小鼠一般狀況顯著改善，肺臟病理損傷明顯減輕，肺水含量及血清TNF-α降低等療效指標(biāo)，共同表明槐定堿可明顯抑制肺組織中LBP、CD14、TLR4的mRNA及TLR4蛋白表達(dá)，進(jìn)而削弱這些識(shí)別受體在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，在細(xì)胞對(duì)LPS的識(shí)別階段即阻斷其所致的病理過程，使過度的炎癥反應(yīng)得到控制，從而減輕因大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生對(duì)肺組織造成的損傷，使得ALI、ARDS的發(fā)生和發(fā)展在早期得到控制。

本研究還進(jìn)一步探討了內(nèi)毒素血癥肺損傷小鼠血清中炎性介質(zhì)TNF-α的產(chǎn)生與LPS識(shí)別受體的關(guān)系，結(jié)果表明槐定堿對(duì)三個(gè)識(shí)別受體表達(dá)與血清TNF-α含量表現(xiàn)出一致的下調(diào)作用，而且槐定堿三個(gè)劑量組抑制血清TNF-α作用有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)其它指標(biāo)的表達(dá)則未顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的劑量-效應(yīng)關(guān)系。此結(jié)果一方面再次驗(yàn)證了槐定堿對(duì)內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織的保護(hù)作用與下調(diào)TNF-α表達(dá)有關(guān)，另一方面也表明槐定堿對(duì)TNF-α分泌的抑制作用，可能來源于其對(duì)LPS激活的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游識(shí)別受體表達(dá)的抑制。

縱觀本文研究結(jié)果，可以認(rèn)為槐定堿干預(yù)使內(nèi)毒素血癥肺損傷小鼠肺組織LBP、CD14和TLR4的轉(zhuǎn)錄及TLR4蛋白表達(dá)顯著下降，從而抑制LPS所致TLR4介導(dǎo)的胞內(nèi)通路的過度活化，進(jìn)而使TNF-α等炎性細(xì)胞因子的生成大大減少，而炎性細(xì)胞因子表達(dá)降低還可反過來下調(diào)LBP、CD14、TLR4受體的表達(dá)，使導(dǎo)致失控性炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)在此時(shí)得到遏制，阻止了肺損傷的惡性發(fā)展。這可能是槐定堿抗內(nèi)毒素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制之一。

然而TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，不僅有不同信號(hào)分子間的直接或間接的相互影響，還存在上下游分子間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)著彼此的功能，要明確搞清槐定堿的作用機(jī)制及對(duì)其他分子的干預(yù)作用，還有待于更深入的研究。

1 Edwin S，Theo J C，Johan Kuiper.Receptors，mediators，and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock［J］.Clin Microbiol Rev，2003;16(3)：379-414.

2 Harrison D A，Welch C A，Eddleston J M.The epidemiology of severe sepsis in England，Wales and Northern Ireland，1996 to 2004：secondary analysis of a high quality clinical database，the ICNARC Case Mix Programme Database［J］.Crit Care，2006;10(2) ：R42.

3 夏玉葉，王大元.槐定堿的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，1997;32(7)：392-393.

4 韓 燕，周 婭，劉 泉.苦豆子抗內(nèi)毒素效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2006;29(7)：1066-1068.

5 Aderem A，Ulevitch R J.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response［J］.Nature，2000;406(6797) ：782-787.

6 Himanshu K ，Taro K，Shizuo A.Pathogen Recognition by Immune System［J］.Int Rev Immunol，2011;30：16-34.

7 Miller S I，Ernst R K，Bader M W.LPS，TLR4 and infectious disease diversity［J］.Nat Rev Microbol，2005;3(1)：36-46.

8 Kawai T，Akira S.The role of patteren recognition receptors in innate immunity：Update on Toll-like receptors［J］.Nat Immunol，2010;11：373-384.

9 Iwasaki A，Medzhiton R.Regulation of adaptive immunity by the innate immune system［J］.Science，2010;327：291-295.

10 Park B S，Song D H，Kim H M et al．The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex［J］.Nature，2009;458：1191-1195.