李研，陳省平，賴小敏，王聰，王娟，袁廣卿，彭毅

生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室是按照我國(guó)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》[1]和《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）[2]等有關(guān)病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，以及 WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》（第三版）[3]中的三級(jí)生物安全（biosafty level 3，BSL-3）防護(hù)標(biāo)準(zhǔn)建立的病原微生物實(shí)驗(yàn)室，是專門針對(duì)通過(guò)氣溶膠或其他途徑傳播，可導(dǎo)致嚴(yán)重后果或生命危險(xiǎn)的內(nèi)源性和外源性病原而特設(shè)的適用于臨床、診斷、教學(xué)、科研的設(shè)施。高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室中所研究的病原體大多數(shù)具有氣溶膠感染的特性[4]。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和近年來(lái)傳染性非典型肺炎（又稱嚴(yán)重急性呼吸綜合癥，severe acute respiratory syndromes，SARS）和高致病性禽流感等疾病的暴發(fā)流行，實(shí)驗(yàn)室生物安全問(wèn)題受到了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注[5]。如何避免實(shí)驗(yàn)室生物安全問(wèn)題的產(chǎn)生已成為科研人員高度關(guān)注的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)室的消毒、滅菌是關(guān)鍵之一。目前，生物安全實(shí)驗(yàn)室多采用物理及化學(xué)的方式來(lái)殺滅實(shí)驗(yàn)室內(nèi)微生物或其他有害病原體。物理的消毒方法主要有紫外線照射、干熱滅菌、壓力蒸汽滅菌、高效空氣過(guò)濾器（high efficiency particulate air filter，HEPA 過(guò)濾器）過(guò)濾等。其中紫外線消毒是大多數(shù)普通生物實(shí)驗(yàn)室采用的消毒方法，但紫外線消毒受很多因素影響，如管理意識(shí)、輻射強(qiáng)度、燈管的使用與保養(yǎng)等[6]。化學(xué)消毒是使用消毒劑來(lái)殺滅病原微生物。在化學(xué)消毒劑中，甲醛熏蒸因?yàn)榫哂袕V譜殺菌、使用方便和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)最為普遍的消毒、滅菌方法[7]。尤其在從事結(jié)核分枝桿菌研究的生物安全實(shí)驗(yàn)室中有氣溶膠傳播的特性，采用甲醛熏蒸能針對(duì)懸浮在空氣中的小顆粒氣溶膠進(jìn)行消毒、滅菌。甲醛消毒原理是使病原體蛋白質(zhì)凝固、還原氨基酸、使蛋白質(zhì)分子烷基化等[8]。我們按照上述國(guó)內(nèi)外法規(guī)、指南和標(biāo)準(zhǔn)，以及本實(shí)驗(yàn)室《生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌手冊(cè)》對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行消毒，用平板培養(yǎng)法和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)法進(jìn)行消毒效果檢測(cè)和驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 自制普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于直徑 9 cm平皿中，經(jīng) 37 ℃ 24 h 培養(yǎng)驗(yàn)證無(wú)菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 甲醛購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，純度為 37%，用單蒸水配制成 36% 甲醛溶液；DNA 抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega bio-tek公司；Taq DNA 聚合酶、Mg2+購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；核酸分子量 marker 購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 F-50 型甲醛熏蒸器購(gòu)自北京克力愛(ài)爾生物有限公司；FORMA3111 型二氧化碳水套式培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Forma 公司；VERITI96-WELL 型 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) ABI 公司；G:BOXEF 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó) Syngene公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室消毒 按房間體積計(jì)算，以 15 ml/m3比例計(jì)算出 36% 甲醛溶液的用量，將定量的甲醛溶液和中和劑氨水分別加入甲醛發(fā)生器內(nèi)相應(yīng)的 A 和 B 槽。按照WHO《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》（第三版）要求，將實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)溫度調(diào)節(jié)高于 25 ℃，相對(duì)濕度在 70% 左右。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)無(wú)工作人員后，關(guān)閉消毒區(qū)域與外界相通的門和傳遞窗，以及中央送風(fēng)系統(tǒng)，遙控啟動(dòng)甲醛發(fā)生器進(jìn)行熏蒸。房間熏蒸 8 h 以上。熏蒸后不立即通風(fēng)，房間密閉 24 h 后，打開(kāi)通風(fēng)系統(tǒng)置換新鮮空氣，直至聞不到刺鼻甲醛氣味。

1.2.2 消毒滅菌效果平板培養(yǎng)法檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室消毒后，用5 個(gè) 9 cm 普通平板培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣沉降 15 min采樣。分別置于實(shí)驗(yàn)室的 4 個(gè)角落以及中央位置，相當(dāng)于人的呼吸道高度[9]。將采樣后的平板置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h 后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌 PCR 特異性檢測(cè) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)易污染部位進(jìn)行甲醛熏蒸消毒前后采樣對(duì)比，包括：實(shí)驗(yàn)室門把手、實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、生物安全柜門把手、顯微鏡調(diào)節(jié)旋鈕、二氧化碳培養(yǎng)箱門把手、冰箱門把手、傳遞窗按鈕以及高壓滅菌器開(kāi)關(guān)及把手等。用浸有無(wú)菌生理鹽水的棉簽往返5 次擦拭各采樣點(diǎn)后，將棉簽浸入采樣管中。所有采樣標(biāo)本用 DNA 試劑盒抽提 DNA 后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 引物序列為：上游引物 5' CAGTGGAATTTCGCGGGTATC 3'，下游引物 5' CGTTGTTCAGCTCGGTAGCC 3'，可特異性擴(kuò)增 200 bp 左右的結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白 6（ESAT-6）基因片段。PCR 反應(yīng)體系包含 cDNA 1 μl，dNTP mix（10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0.125 μl（5 U/μl），Mg2+（25 mmol）3 μl 和5 × PCR buffer 5 μl，加重蒸水至 25 μl。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，循環(huán) 35 次；最后 72 ℃ 7 min 終止反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。以 1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 PCR 產(chǎn)物，凝膠成像儀下觀察記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 普通平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)

平板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)室 4 個(gè)角落及中央位置菌落數(shù)分別為 0、2、1、0、0。符合生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的消毒滅菌要求。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果

圖 1 為消毒前 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照（2 號(hào)加樣孔）和生物安全柜操作臺(tái)面（4 號(hào)加樣孔）有約為 200 bp 左右的陽(yáng)性擴(kuò)增片段，其余各取樣擴(kuò)增管（3、5 ～ 10 號(hào)加樣孔）及陰性對(duì)照（1 號(hào)加樣孔）未見(jiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增片段，說(shuō)明熏蒸前實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面有污染。

圖 2 為熏蒸后 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照（2 號(hào)加樣孔）可見(jiàn) 200 bp 左右的擴(kuò)增片段，但各取樣擴(kuò)增管（3 ～ 10 號(hào)加樣孔）及陰性對(duì)照（1 號(hào)加樣孔）未見(jiàn)擴(kuò)增片段，說(shuō)明熏蒸消毒、滅菌后各取樣點(diǎn)未檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌核酸序列，提示實(shí)驗(yàn)室已無(wú)細(xì)菌污染，達(dá)到消毒滅菌效果。

3 討論

圖 1 熏蒸前 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果

圖 2 熏蒸后 PCR 擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌基因片段結(jié)果

目前生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)送排風(fēng)系統(tǒng)并經(jīng)過(guò)初、中、高效過(guò)濾器過(guò)濾，保證了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)空氣潔凈度為萬(wàn)級(jí)到十萬(wàn)級(jí)；同時(shí)輔助工作區(qū)與緩沖間之間，以及緩沖間與核心實(shí)驗(yàn)室之間形成國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的負(fù)壓（遞增）梯度現(xiàn)狀，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員提供有效的生物防護(hù)。但在開(kāi)展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí)難免會(huì)有操作臺(tái)面等的污染。因此，我們進(jìn)行了甲醛熏蒸消毒滅菌效果驗(yàn)證的系統(tǒng)研究。通過(guò)瓊脂平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和 PCR 檢測(cè)驗(yàn)證了甲醛熏蒸消毒的有效性。前者根據(jù)消毒滅菌操作后實(shí)驗(yàn)室空間普通細(xì)菌殘留的數(shù)量間接檢測(cè)消毒滅菌的效果，但由于受實(shí)驗(yàn)室本身潔凈度等因素的影響，這種方法只能作為消毒滅菌效果驗(yàn)證的初步和補(bǔ)充方法；而后者由于能特異性檢測(cè)所操作的病原體核酸，具有方法簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感等特點(diǎn)[10]，可作為實(shí)驗(yàn)室空間及儀器設(shè)備污染與否和消毒滅菌效果驗(yàn)證最為準(zhǔn)確的方法，實(shí)際操作時(shí)可選擇在每次、周、月實(shí)驗(yàn)結(jié)束清場(chǎng)（消毒滅菌）后定期和不定期，以及一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后終末消毒滅菌效果驗(yàn)證時(shí)進(jìn)行。應(yīng)注意取樣點(diǎn)的代表性和完整性，同時(shí)定期和不定期配合使用特定病原體的培養(yǎng)方法作補(bǔ)充。甲醛是一種高效的消毒劑，可通過(guò)熏蒸發(fā)生，使用起來(lái)簡(jiǎn)單、方便、有效，對(duì)消毒物品無(wú)損害。但由于甲醛消毒效果受消毒環(huán)境的溫度、濕度、工作濃度以及熏蒸時(shí)間等因素的影響[4]，因此，在消毒時(shí)要嚴(yán)格控制條件以達(dá)到良好的消毒、滅菌效果。此外，因甲醛消毒后會(huì)有殘留，要注意人工擦拭去除表面的微量殘留[8]。實(shí)際使用時(shí)還要注意根據(jù)所消毒物品的性質(zhì)和空間大小（如實(shí)驗(yàn)室房間、生物安全柜等）的不同，選擇適合的，不同規(guī)格、型號(hào)、能產(chǎn)生足量蒸汽的甲醛發(fā)生器。

[1] The State Council of People’s Republic of China. The regulation of biological safety of pathogenic micro-organism laboratory. 2004-11-12. (in Chinese)中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院. 病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例.2004-11-12.

[2] China National Accreditation Committee for Laboratories. GB 19489-2008 Laborotories-general requirements for biosafety. Beijing:Standards Press of China, 2008. (in Chinese)中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). GB 19489-2008 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[3] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed.Geneva: World Health Organization, 2004. (in Chinese)世界衛(wèi)生組織. 實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè). 3版. 日內(nèi)瓦: 世界衛(wèi)生組織, 2004.

[4] Bi JJ, Wang Z, Chen JJ, et al. Safe disposal of wastes from high-level biosafety laboratories. Bull Acad Mil Med Sci, 2006, 30(4):394-397.(in Chinese)畢建軍, 王壯, 陳潔君, 等. 高級(jí)別生物安全實(shí)驗(yàn)室廢棄物安全處置. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊, 2006, 30(4):394-397.

[5] Wang QD. Management of the laboratory biosafty of our country.Chin Med Biotechnol, 2007, 2(1):6-8. (in Chinese)王秋娣. 我國(guó)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2007, 2(1):6-8.

[6] Li MJ, Yuan Z, Liu J, et al. Influencing factors of ultraviolet ray disinfection in the laboratory for cell culture and its countermeasures.Lett Biotechnol, 2010, 21(3):453-454. (in Chinese)李盟軍, 袁征, 劉劍, 等. 影響細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室紫外線消毒效果的因素及對(duì)策. 生物技術(shù)通訊, 2010, 21(3):453-454.

[7] Han YQ, Liu YJ. Study on the action of the multiple factors influencing disinfection efficacy of formaldehyde fumigation.Disinfection Sterilization, 1989, 6(3):132-138. (in Chinese)韓友圻, 劉育京. 甲醛熏蒸消毒多因素影響作用的研究. 消毒與滅菌, 1989, 6(3):132-138.

[8] Xia DS, Chen HJ. Study on disinfection residual effect verification and validation method of formaldehyde. Shanxi Med J, 2011,40(7):720-721. (in Chinese)夏德生, 陳慧嬌. 甲醛消毒效果驗(yàn)證及殘留驗(yàn)證方法研究. 山西醫(yī)藥雜志, 2011, 40(7):720-721.

[9] Wang QS, Zhou ZM, Gao Y. Practical handbook of medical media.Beijing: People’s Military Medical Press, 1999. (in Chinese)王欽升, 周正明, 高屹. 實(shí)用醫(yī)學(xué)培養(yǎng)基手冊(cè). 北京: 人民軍醫(yī)出版社, 1999.

[10] Wu HH, Ye ML, Li XD. Screening of random primer and optiming of reaction system for arbitrarily primed polymerase chain reaction on 8 sorts of bacteria. Chin J Nosocomiol, 2003, 13(12):1104-1106. (in Chinese)吳海寰, 葉明亮, 李曉娣. 細(xì)菌隨機(jī)引物聚合酶鏈反應(yīng)分析中隨機(jī)引物的篩選與反應(yīng)體系的優(yōu)化. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2003, 13(12):1104-1106.