王琴

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京市 100081）

1 豬瘟流行情況

世界動物衛(wèi)生組織 （OIE）在2000年至2012年發(fā)布的豬瘟 （CSF）在全球的流行報告顯示，CSF主要于中南美洲、亞洲和歐洲三大區(qū)域流行，全球CSF的流行情況較穩(wěn)定。但從2005年開始有報道在非洲南部CSF也多次發(fā)生。

CSF分子流行病學(xué)調(diào)查研究對闡明豬瘟病毒 （CSFV）的遺傳變異特征和規(guī)律，掌握當(dāng)前的流行現(xiàn)狀，溯源和追蹤C(jī)SF疫情發(fā)生的來源和去向，監(jiān)測現(xiàn)行使用疫苗的有效性，建立分子流行病學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)，提出新的防控策略具有十分重要的科學(xué)意義。國際上將CSFV分為3個基因群 （Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群），10個基因亞群 （1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和 3.4）。 近年來，我國CSFV分子流行病學(xué)研究取得了很大進(jìn)展。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、軍事醫(yī)學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所和中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心調(diào)查了32個省市自治區(qū)，覆蓋了我國98%的國土面積，對554條中國CSFV流行毒株的基因進(jìn)行了檢測。分析結(jié)果表明，中國流行的CSFV分屬以下四個基因亞群：2.1、2.2、2.3和1.1。 以 基 因2群 （ 占73.82%） 為主， 其次是1群 （占26.18%），一直沒有監(jiān)測到基因3群的傳入與流行。但在周邊國家如韓國、泰國及我國臺灣地區(qū)均有基因3群，應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)測。近年中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實驗室的數(shù)據(jù)顯示，從2011年至今，僅檢測到2.1亞群，未檢測到1.1亞群；1999年以后未檢測到2.3亞群，2008年以后未檢測到2.2亞群。研究表明我國CSFV遺傳變異情況在32年間處于較穩(wěn)定狀態(tài)。

近十幾年，CSF在我國的大部分省市也多次發(fā)生。現(xiàn)國內(nèi)CSF流行特點如下：流行范圍廣，呈散發(fā)流行；豬發(fā)病年齡小，成年豬帶毒現(xiàn)象嚴(yán)重；發(fā)病時典型特征和非典型特征同時存在，非典型癥狀和繁殖障礙型CSF增多，混合感染嚴(yán)重；多見免疫失敗導(dǎo)致的CSF發(fā)生。由于中國存在不同的養(yǎng)殖模式，尤其是小型農(nóng)場和散養(yǎng)，因此根除CSF依然是一個巨大挑戰(zhàn)。

2 中國豬瘟長期持續(xù)存在的現(xiàn)狀以及豬瘟慢性感染的機(jī)制研究

2.1 中國豬瘟長期持續(xù)感染的現(xiàn)狀

CSFV感染的主要方式分為急性感染、亞急性感染和慢性感染。其中，CSF慢性感染指病毒逃逸免疫監(jiān)視感染宿主，并在機(jī)體內(nèi)持續(xù)增殖，可不斷地或間歇性地向體外排毒。通常情況下不表現(xiàn)臨床癥狀，呈隱性經(jīng)過，發(fā)作慢而溫和，死亡率低，其病程一般超過1～3個月，甚至更長。尤其是母豬在臨床上沒有任何癥狀，體況良好，但是攜帶病毒。這種母豬的垂直傳播率高達(dá)45%～100%，不僅可引起母體內(nèi)胎兒死亡，影響胎兒發(fā)育，產(chǎn)木乃伊或死胎，更容易忽略的是產(chǎn)下貌似健康的帶毒仔豬并長期帶毒。這種帶毒仔豬無論是吃初乳，還是免疫接種疫苗，均不能消除體內(nèi)的病毒，臨床上表現(xiàn)為仔豬發(fā)病、死亡或造成免疫失敗現(xiàn)象。一旦帶毒豬作為后備種豬，這種帶毒現(xiàn)象將持續(xù)存在并形成惡性循環(huán)。這種持續(xù)感染的病毒可在豬體內(nèi)長期存在并不斷排向外界，引起易感豬感染，造成豬的發(fā)病和死亡。病理學(xué)研究還證明：這種CSFV持續(xù)感染的母豬盡管不表現(xiàn)臨床癥狀，但可造成卵巢病理變化，卵泡結(jié)石化，降低或失去排卵功能，嚴(yán)重影響繁殖力。CSFV對胎兒的致病作用也隨著胎次增多而加強(qiáng)，這就是臨床上母豬表現(xiàn)久配不孕現(xiàn)象的主要原因。

人工CSFV持續(xù)感染動物模型的建立和研究也表明，帶毒母豬不僅可以垂直或水平傳播CSFV，帶毒種公豬也會傳播CSFV。帶毒種公豬既可水平傳播CSF，又可通過配種或精液傳播給母豬，并經(jīng)母豬垂直感染仔豬，帶毒仔豬又可繼續(xù)水平或垂直傳播CSF，這是造成CSFV持續(xù)感染的重要原因。人工構(gòu)建的這種持續(xù)感染的CSFV至少可在母豬體內(nèi)維持750天，這種情況常常導(dǎo)致CSF在豬場形成惡性循環(huán)，即無臨床癥狀的持續(xù)感染帶毒母豬→胎盤垂直感染→母豬繁殖障礙→仔豬帶毒→無臨床癥狀的持續(xù)感染帶毒后備母豬→無臨床癥狀的持續(xù)感染帶毒母豬。在臨床上，種豬有3%～33%的帶毒率，從而導(dǎo)致免疫失敗。這是造成我國CSF長期持續(xù)存在和散發(fā)流行惡性循環(huán)的主要根源，這種持續(xù)帶毒現(xiàn)象對CSF的控制產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。

2.2 豬瘟慢性感染對豬免疫功能影響的細(xì)胞與分子機(jī)制研究

國外曾報道過慢性CSF人工感染的實驗研究，但未就CSFV的致病性特征進(jìn)行系統(tǒng)研究。我國對慢性CSF的研究更多集中在臨床癥狀的報道，而非進(jìn)一步的病理機(jī)制研究；研究多集中在體外實驗，CSFV慢性感染對于豬外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響尚不清楚；此外，CSFV慢性感染后外周單核細(xì)胞（PBMC）中抗病毒基因轉(zhuǎn)錄影響的研究較少，不能清楚的解釋CSFV慢性感染對免疫因子的影響。由此，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所開始從機(jī)制上研究CSF慢性感染對豬免疫功能的影響。2011年再次建立了人工CSFV持續(xù)感染動物模型并對其進(jìn)行研究，采用一株中等致病力的毒株 （HeBHH1/95）感染16頭實驗用豬，同時設(shè)豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）組和空白對照組。然后記錄臨床癥候，定期采集前腔靜脈血和隨機(jī)剖殺1～2頭感染豬，采集26種組織器官樣本。通過蘇木精—伊紅 （HE）染色技術(shù)和免疫組化進(jìn)行病理學(xué)研究，通過對免疫相關(guān)因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的分析和淋巴細(xì)胞總數(shù)及亞群數(shù)量變化分析進(jìn)行免疫因子變化的研究，通過FQPCR法檢測各組織中CSFV核酸載量的動態(tài)分布，研究各個組織器官的病毒載量，采用抗體ELISA技術(shù)檢測抗體消長情況，系統(tǒng)地分析中等致病力CSFV毒株感染及疫苗免疫對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。

CSFV慢性感染后的整個病程45天，根據(jù)臨床記分和體溫曲線將病程分為三個時期： 1～7 DPI(感染后 1～7天)是潛伏期，沒有出現(xiàn)典型臨床癥狀；7～24 DPI為發(fā)病期，呈現(xiàn)典型的CSF臨床癥狀；25～45 DPI是轉(zhuǎn)歸期，可見斷尾、斷耳、毛焦體瘦的僵豬特點。HE染色顯示，大部分組織器官在潛伏期病理變化基本正常，發(fā)病期病變典型，尤其是淋巴結(jié)組織表現(xiàn)為嚴(yán)重的出血、水腫特征，轉(zhuǎn)歸期除淋巴器官外其它組織的病變均有減輕的趨勢。采用豬瘟單抗WH303進(jìn)行的免疫組織化學(xué)研究顯示，在各個組織器官表現(xiàn)了與上述HE染色相應(yīng)的病毒陽性信號和動態(tài)分布情況，3個時期的病變和免疫組織化學(xué)研究結(jié)果是一致的。

CSFV感染組豬的外周血淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量總數(shù)呈下降趨勢。淋巴細(xì)胞在感染早期的數(shù)量顯著降低，2 DPI具有直接殺傷能力的Tc細(xì)胞、γδT細(xì)胞和Th細(xì)胞的數(shù)量開始降低，9 DPI不具有直接殺傷能力的活化記憶T細(xì)胞數(shù)量開始降低。在不同感染時期，CSFV誘導(dǎo)不同類型的T淋巴細(xì)胞數(shù)量的降低，導(dǎo)致后期機(jī)體免疫能力下降，臨床癥狀的出現(xiàn)及病癥加重。相反，HCLV免疫組在5 DPV（免疫后5天）時淋巴細(xì)胞數(shù)量上升，尤其在12 DPV達(dá)到高峰，且與對照組差異顯著 （P＜0.05），而后逐漸下調(diào)并趨于穩(wěn)定，Tc細(xì)胞、γδT細(xì)胞變化不明顯，Th細(xì)胞在5～12 DPV略有增加。表明HCLV免疫能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增加，對細(xì)胞免疫功能具有增強(qiáng)作用。

深入到分子水平，感染組在感染HeBHH1/95豬瘟病毒后，所有抗病毒因子轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，在后期轉(zhuǎn)錄水平趨于穩(wěn)定，這表明CSFV具有逃避機(jī)體抗病毒細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫保護(hù)的能力。而免疫組在免疫后期，IL-2、IL-4、IFN-α、IFN-β、OAS （寡腺苷酸合成酶）轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，顯示HCLV能夠提高機(jī)體的細(xì)胞免疫能力。IL-8在5 DPV轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，可促進(jìn)Th細(xì)胞增殖，從而協(xié)助成熟的B細(xì)胞活化成漿細(xì)胞，分泌抗體。因此通常在12 DPV采用ELISA可檢測到抗體。相比CSF急性感染，雖然慢性感染病程中各個組織器官中的病毒載量明顯低于急性感染，但要指出的是在扁桃體中病毒載量較高。

綜上所述，通過構(gòu)建CSF慢性感染動物模型，系統(tǒng)研究了慢性感染臨床癥候、病理學(xué)、組織學(xué)、病毒載量、外周血細(xì)胞及免疫相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄的變化。慢性感染中CSFV的主要復(fù)制場所為淋巴器官，且對淋巴器官具有持續(xù)性的、不可恢復(fù)性的損傷，對其他組織的損傷具有可恢復(fù)性；扁桃體依然是檢測慢性感染豬的最敏感、方便的組織之一；系統(tǒng)分析了CSFV在逃避宿主免疫因子作用和形成特異性抗體中起關(guān)鍵作用細(xì)胞因子，為探索細(xì)胞因子作用奠定了基礎(chǔ)，為闡述CSFV慢性感染和免疫的機(jī)制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

3 我國豬瘟防制對策

3.1 我國豬瘟防制與凈化的支撐條件

通過上述CSFV分子流行病學(xué)研究，弄清了中國CSFV的遺傳衍化背景，填補(bǔ)了國際上CSFV分子流行病學(xué)研究缺乏中國數(shù)據(jù)這一空白，表明CSFV基因組穩(wěn)定，變異頻率低，只有一個血清型，對該病毒的清除是一個有利的條件。在此基礎(chǔ)上創(chuàng)新性的建立了CSF流行病學(xué)信息系統(tǒng) （CSFinfo），使我們成為全球繼德國之后第二個有這種數(shù)據(jù)庫的國家。CSFinfo對加強(qiáng)CSF流行病學(xué)信息的統(tǒng)一管理，掌握全球CSF數(shù)據(jù)，分析CSF傳播來源，建立一整套連續(xù)、可靠、完整、系統(tǒng)的國內(nèi)外CSF流行病學(xué)資料，對我國CSF防控具有十分重要的意義。CSF慢性感染對豬免疫功能影響的細(xì)胞與分子機(jī)制研究從理論上闡明了我國豬瘟長期存在的原因，為制定免疫程序、淘汰抗體水平低下的帶毒豬提供了理論依據(jù)。對HCLV進(jìn)行再評價研究，證明了我國目前使用的HCLV能抵抗全世界流行的3個基因群的攻擊，還證明目前我國國內(nèi)生藥廠家生產(chǎn)的HCLV是穩(wěn)定的，HCLV種毒并不像人們懷疑的那樣發(fā)生了變異。為我國使用HCLV進(jìn)行高密度 （100%）強(qiáng)制免疫的政策提供了堅實的理論基礎(chǔ)。尤其是CSF診斷技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，大量實驗結(jié)果顯示，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的系列方法彌補(bǔ)了我國CSF病原檢測的空白， CSF病原檢測試劑盒相關(guān)指標(biāo)達(dá)到歐盟參考實驗室技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，抗體檢測試劑盒相關(guān)指標(biāo)達(dá)到了進(jìn)口商品化試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)，可實現(xiàn)CSF病原檢測和CSF抗體檢測試劑盒的國產(chǎn)化，提升我國CSF診斷水平，為獲得國際貿(mào)易認(rèn)可鋪平了道路，具有很好的推廣應(yīng)用前景和極大的產(chǎn)業(yè)化價值。利用這些技術(shù)建立并完善我國系列CSF診斷技術(shù)，進(jìn)而改進(jìn)和完善我國CSF預(yù)防控制策略。至此，本實驗室在CSF診斷、疫情監(jiān)測、分子流行病學(xué)調(diào)查分析等所需的檢測方法已經(jīng)系統(tǒng)建立，已經(jīng)成為國內(nèi)建立和掌握CSF診斷技術(shù)最全的實驗室之一。在此基礎(chǔ)上，國家 “十一五”科技支撐計劃實施了 《規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范實施方案》項目，研究提出了針對我國CSF流行狀況的新型CSF凈化模式。

3.2 豬瘟新型凈化模式的建立

CSF是我國政府計劃要根除的重要傳染病，通過 “十一五”科技支撐計劃《豬瘟、豬偽狂犬病綜合防空集成與示范》項目的實施，集成上述系列技術(shù)，按照準(zhǔn)備階段→控制階段→強(qiáng)制凈化階段→監(jiān)測階段→認(rèn)證階段等五個凈化程序，通過對CSF快速診斷試劑盒，疫苗毒株和致病毒株鑒別診斷方法的篩選和整合，免疫程序的調(diào)整，生物安全措施的綜合實施，取得了很好的效果。對CSF嚴(yán)重污染場，CSF病原陽性率分別從 2006年的 7.08%～11.49%下降至2010年的0%～2.07%，達(dá)到基本清除CSF的目標(biāo)；對CSF一般污染場，陽性率分別從0.87%～3.09%下降至0%，清除CSF；CSF免疫合格率總體上升，從2006年的 67.30%～90.67%上升至 2010年的85.00%～96.32%，達(dá)到了基本無疫或無疫，成功地在15個規(guī)?；B(yǎng)豬示范場使7個場凈化了CSF，示范場生產(chǎn)指標(biāo)得到了全面改善，提升了養(yǎng)豬場的疫病防控能力，經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)步提高。通過項目的實施，構(gòu)建了符合我國國情的規(guī)?；i場CSF的不同凈化模式，形成了一系列的指導(dǎo)方案，制定了 《規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范實施方案》、《規(guī)模化豬場豬瘟凈化技術(shù)指南》、《集約化、規(guī)?；i場生物安全體系的實施方案》和《“豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范”課題種豬凈化認(rèn)證方案建議》等指南，取得的重要創(chuàng)新性成果，可用于指導(dǎo)我國CSF的防控和凈化。

4 結(jié)語

長期以來，CSF是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)最主要的疫病，目前依然是各級政府計劃要根除的重大豬病。上述研究表明CSF的病毒基因組比較穩(wěn)定，且只有一個血清型，這對該病毒的清除是一個有利條件。CSF慢性感染對豬免疫功能影響的細(xì)胞與分子機(jī)制研究從理論上闡明了我國豬瘟長期存在的原因，為制定免疫程序、淘汰抗體水平低下的帶毒豬提供了理論依據(jù)。豬瘟疫苗的再評價研究為我國繼續(xù)使用HCLV進(jìn)行高密度（100%）強(qiáng)制免疫政策奠定了重要的基礎(chǔ)。同時我們研發(fā)的診斷技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國際技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，并被國際上認(rèn)可。尤其是 “十一五”期間對我國部分養(yǎng)豬場凈化CSF的成功先例表明，在我國目前豬病流行狀態(tài)下，在規(guī)?；i場和部分區(qū)域開展CSF的凈化，逐步根除是完全可行的。